Анализ генетического материала единичных клеток является весьма актуальной задачей для таких областей науки, как онкология, судебная медицина, преимплантационная генетическая диагностика. Полногеномная амплификация является неотъемлемым этапом в исследовании единичных клеток. Среди методов полногеномной амплификации выделяют методы, основанные на термоциклировании, и изотермические методы. Каждый из методов полногеномной амплификации должен обеспечивать максимально возможную представленность и пропорциональность всех участков исследуемого генома, а также обладать минимальным смещением, то есть наиболее точно представлять первичную последовательность ДНК в продуктах полногеномной амплификации. На вышеперечисленные характеристики могут влиять используемые в методах полногеномной амплификации типы праймеров, полимеразы, а также исходное качество и количество исследуемой ДНК. Поэтому в зависимости от используемого протокола качество амплификации может значительно различаться, что, несомненно, должно учитываться при выборе метода полногеномной амплификации в соответствии с поставленной целью исследования.

Приоритетным направлением в профилактике врожденных пороков и хромосомных аномалий у детей и предупреждении младенческой смертности, инвалидности, заболеваемости от данного вида патологии является пренатальная диагностика (ПД). Ведущим мероприятием в ней сегодня определен ранний пренатальный скрининг (РПС), выполняющийся централизованно на экспертном уровне диагностики и позволяющий в сроки 11-14 недель с 85% чувствительностью выявить частые хромосомные трисомии (ХА) и грубые анатомические дефекты (ВПР) у плода. С 2014 года Минздрав РФ проводит ежегодный внешний контроль качества мероприятий РПС и оценивает его эффективность по оригинальным данным из единого для всех субъектов программного обеспечения системы РПС. В 2017 году с данными за 2016 год в аудите приняло участие 77 субъектов и 3 зональных представителя. При среднем охвате 80% в 2016 году в субъектах РФ РПС прошли 1185274 беременных. В сроках 11-14 недель беременности пренатально было выявлено 2857 ВПР и 3195 ХА.

Синдром Шарко-Мари-Тута (ШМТ) является одним из наиболее частых дегенеративных неврологических заболеваний с частотой встречаемости 1 на 2500. Примерно 70-80% всех случаев ШМТ составляет ШМТ1, вызванная дупликацией 1,5 млн п.н. в районе 17p11.2, включающей ген PMP22 . Преимплантационная генетическая диагностика (ПГД) патогенного генетического варианта становится мощным инструментом для профилактики заболевания. Ранее была предложена тест-система для косвенной ПГД ШМТ1 с использованием 1-5 полиморфных локусов. Однако в условиях ПГД анализ по 1-5 маркерам с неполной информативностью не может считаться высокодостоверным. В статье представлен опыт проведения ПГД ШМТ1 с применением тест-системы из 27 полиморфных маркеров, позволяющей проводить косвенную диагностику указанной дупликации и точковых мутаций в гене PMP22 с высокой точностью.

В статье представлены результаты исследования 38 пробандов женского пола с входящим диагнозом «мышечная дистрофия Дюшена/Беккера». С целью установления молекулярно-генетической причины болезни всем пробандам проведен поиск делеций/дупликаций гена DMD , исследование числа половых хромосом и их лайонизации, поиск мутаций в генах аутосомно-рецессивных поясно-конечностных мышечных дистрофий (ПКМД) имеющих пересекающийся спектр фенотипических проявлений с мышечной дистрофии Дюшена/Беккера: CAPN3, FKRP , SGCA, SGCB, SGCG, SGCD. Причина мышечной дистрофии была установлена у 45% обследованных пробандов. Показана невозможность подтверждения диагноза мышечной дистрофиии у женщин на основании выявления несбалансированной лайонизации Х-хромосом. На основе результатов исследования генов саркогликанов разработана новая медицинская технология «Система детекции в одной пробирке частых мутаций при саркогликанопатиях».

Врожденная наследственная несиндромальная аниридия (ВА) - моногенный врожденный порок развития органа зрения с аутосомно-доминантным типом наследования, встречающийся в популяции с частотой 1:45 000-100 000 населения. ВА характеризуется врожденным отсутствием радужной оболочки глаза или врожденной гипоплазией большей ее части. ВА может быть: несиндромальной, которая, однако, часто затрагивает все структуры глаза (75 % случаев) и синдромальной (20%, включая WAGR синдром). Часть форм ВА, как изолированной, так и синдромальной, обусловлена гетерозиготными мутациями в гене PAX6 и хромосомными перестройками, вовлекающими регион 11p13. Делеции в том же регионе, но с вовлечением, помимо гена PAX6, еще и гена WT1 приводят к синдрому WAGR. В исследование включены 110 пациентов с предположительным диагнозом изолированная врожденная аниридия из 84 неродственных семей и 7 пациентов из 7 неродственных семей - с диагнозом синдром WAGR . Применяемая комплексная подтверждающая и дифференциальная ДНК-диагностика ВА и синдрома WAGR состоит из двух основных последовательных этапов: MLPA анализа (с подтверждением обнаруженных делеций с помощью анализа потери гетерозиготности или FISH) и секвенирования по Сэнгеру. Эффективность применения MLPA-анализа в качестве первоначального метода диагностики составляет 33% (30/91). Эффективность применения секвенирования в качестве единственного метода диагностики ВА вне предлагаемой комплексной технологии в выборке российских больных составила бы 63,7% (58/91). В результате использования предлагаемой технологии диагноз подтвержден у 107 пациентов (81 пробанда) с несиндромальной ВА и 7 пациентов с синдромом WAGR, определены частые в выборке пациентов из России PAX6 мутации. Эффективность применения двух последовательных этапов комплексной технологии подтверждающей и дифференциальной диагностики ВА в выборке пациентов из России составила 96,7% (88/91).

Варфарин назначается большому количеству пациентов при различных заболеваниях, однако существуют 20-кратные межиндивидуальные различия требуемой дозировки; превышение же необходимой дозы чревато осложнениями в виде кровотечений различной локализации, вплоть до развития жизнеугрожающих состояний. Известны генетические факторы, оказывающие существенное влияние на метаболизм варфарина в организме. Цель настоящего исследования заключалась в разработке набора олигонуклеотидов и методики генотипирования генетических полиморфизмов, влияющих на эффективность действия варфарина. Разработанная мультиплексная панель включает 6 полиморфных вариантов в генах биотрансформации, сочетания генотипов которых определяют подбор правильной дозы варфарина: CYP2C9 (rs1799853, rs1057910), VKORC1 (rs9923231, rs8050894), CYP4F2 (rs2108622) и GGCX (rs11676382). Для разработки набора проб были проанализированы тип генотипируемых замен, и характеристики ДНК в регионе данных SNP; возможность мультиплексирования проверяли на основании результатов реакции с набором Primer Focus Kit. Проведено мультиплексное генотипирование контрольных образцов ДНК с известными генотипами. Генотипы, определенные методом SNaPshot-анализа соответствовали полученным стандартными методами. Таким образом, разработана и верифицирована панель проб для мультиплексного генотипирования шести SNP, связанных с индивидуальной чувствительностью к варфарину. Использование в клинической практике результатов данного анализа позволит повысить эффективность антикоагулянтной терапии и снизить частоту проявления побочных эффектов.

Симптоматическое и патогенетическое лечение муковисцидоза позволило увеличить продолжительность жизни пациентов до 30 лет, однако заболевание до сих пор остается неизлечимым. Технологии генной терапии, основанные на использовании специфических нуклеаз, открывают новые возможности в разработке этиотропной терапии наследственных заболеваний. Наиболее широко используемым методом геномного редактирования является CRISPR/Cas9. Цель работы: сравнение эффективности редактирования гена CFTR с использованием разных направляющих РНК (sgRNA), подобранных для коррекции мутации F508del, и повышение их активности. В работе использовали модифицированную spCas9 (eSpCas9) и две sgRNA, подобранные на последовательность гена CFTR : sgCFTR#1 - непосредственно на мутацию F508del, sgCFTR#2 - за 14 нуклеотидов от мутации в 5’-области. В качестве контроля работы нуклеазы использовали sgGFP, подобранную на последовательность гена GFP . Матрицей для sgCFTR#1 и #2 выступала плазмида pGEM-TA-CFTR с частью гена CFTR с мутацией F508del, ко-трансфицированная с плазмидой для CRISPR/Cas9, для sgGFP - плазмида pEGFP-C1. На культуре HEK293T показано, что sgCFTR#1 имеет наименьшую эффективность среди используемых sgRNA - количество инсерций/делеций (инделов) при T7E1 анализе составило 6,37-20,82%; уровень экспрессии sgCFTR#1 после трансфекции ниже, чем sgGFP, продемонстрировавшей наибольшую активность - до 65% инделов. Добавление G-квадруплексов в последовательность sgCFTR#1 и sgGFP для повышения их стабильности привело к уменьшению их экспрессии и активности. Культивирование трансфицированных клеток при более низкой температуре (24 часа при 37°С, затем 48 часов при 30°С) привело к двукратному снижению активности sgCFTR#1, не изменив при этом активность sgGFP. Таким образом, в работе получена прямая взаимосвязь между экспрессией направляющей РНК и ее активностью, однако экспрессию sgCFTR#1 и эффективность ее работы повысить не удалось. Необходимо предпринимать дальнейшие попытки усиления экспрессии sgCFTR#1 и ее стабилизации, либо использовать другие Cas9, расширяющие возможности подбора направляющих РНК на мутацию F508del.

У больной 12 лет с очень ранней эпилепсией (ремиссия), отставанием в психомоторном развитии, гиперкинетическим синдромом и умеренным лактат-ацидозом методами панельного экзомного секвенирования и подтверждающего секвенирования по Сэнгеру выявлены две независимые редкие болезни с частично перекрывающимися фенотипами: аутосомно-доминантная младенческая эпилептическая энцефалопатия 42-го типа (ранее описанная мутация p.Ala713Thr de novo в гене CACNA1A ) и аутосомно-рецессивная недостаточность комплекса I дыхательной цепи митохондрий (компаунд-гетерозиготность по ранее описанным мутациям p.Trp22Arg и p.Cly70* в гене NDUFB3 ). Обcуждается клиническое разнообразие выявленной NDUFB3 -связанной болезни.

Х-сцепленная умственная отсталость, тип Кантагреля (MIM #300912; ORPHA:85277) характеризуется выраженной неонатальной гипотонией умственной отсталостью, задержкой психомоторного развития, отсутствующей или слабо развитой речью, аутистическими чертами характера (стереотипные движения рук и стереотипное поведение), послеродовой задержкой роста и микроцефалией. В статье приводится описание случая выявления мутации в гене KIAA2022 у девочки 5 лет с эпилепсией, выраженной задержкой психомоторного, речевого и интеллектуального развития, нарушением поведения и аутистическими чертами характера. При проведении генетического исследования выявлена ранее не описанная гетерозиготная мутация в экзоне 3 гена KIAA2022 - p.Asp451fs, валидированная методом секвенирования по Сэнгеру. У родителей ребенка мутация не найдена. При исследовании CAG-повтора экзона 1 гена AR у пробанда неслучайная инактивация X-хромосомы не выявлена. Мутации в гене KIAA2022 могут быть причиной эпилептической энцефалопатии и умственной отсталости не только у мальчиков, но и у девочек, что имеет важное значение для определения тактики генетического тестирования, медицинского сопровождения и медико-генетического консультирования

Актуальность: Врожденные и наследственные болезни в значительной мере представлены хромосомной патологией. В связи с этим ранняя диагностика, своевременно начатые лечение и реабилитация, профилактика возникновения и распространения этих заболеваний имеют особое значение. Цель: Используя комбинацию молекулярно-цитогенетических методов, литературные данные и исследуя несколько типов клеток, выяснить генетические причины заболевания у пациента. Материалы и методы: У пробанда взяты лимфоциты периферической крови и фибробласты кожи. Исследование проведено путем метафазного анализа, матричной сравнительной геномной гибридизации (aCGH) на микрочипах 8х 60K (Agilent Technologies), ПЦР в реальном времени и флюоресцентной in situ гибридизации (FISH). Результаты: У пациента с цитогенетически визуализируемой кольцевой хромосомой 13 - r(13) - выявлены симптомы, не ассоциированные с данной хромосомной аномалией. Кроме терминальной делеции 13q34, обусловившей r(13), идентифицирована трипликация 3q12. В фибробластах в ходе микрочипового исследования дополнительно обнаружена моносомия 13. Методом FISH-анализа установлено, что доля лимфоцитов и фибробластов с моносомией по хромосоме 13 составила 47% и 50% соответственно. Выводы: В случае хромосомной патологии объяснить все симптомы пациента, дать объективный прогноз заболевания и предложить лечение позволяет комплексный подход, включающий в себя применение адекватных методов исследования, анализ нескольких тканей в сложных случаях, работу с литературными данными и базами и взаимодействие врачей и специалистов разного профиля.