Профилактика хромосомных болезней через преимплантационную генетическую диагностику становится актуальным востребованным направлением современной репродуктивной медицины и генетики. Скрининг эмбрионов в рамках циклов экстракорпорального оплодотворения позволяет исключить перенос анеуплоидных бластоцист, обеспечивая повышение вероятности наступления беременности и рождения здорового ребенка, а также снижая риски репродуктивных потерь вследствие хромосомной патологии. В настоящем обзоре обсуждается современное состояние технологий преимплантационного генетического тестирования хромосомного статуса эмбрионов, сохраняющиеся в этой сфере проблемы, а также перспективные направления исследований, призванные дать решение возникающим вызовам.

Преимплантационная генетическая диагностика (тестирование) (ПГД/ПГТ) моногенных заболеваний направлена преимущественно на предотвращение рождения ребенка с наследственным заболеванием посредством обследования эмбрионов до имплантации в лечебном цикле ЭКО (экстракорпорального оплодотворения). Строгим показанием для ПГД генной болезни служит высокий риск рождения ребенка с тяжелой формой многогенного заболевания при отсутствии противопоказаний и ограничений. С расширением показаний для ПГД и возможностей генетического тестирования возникают вопросы по нормативному регулированию и этической ответственности врача при проведении процедуры. Этические вопросы возникают, когда генетический риск ниже показателя, расцениваемого как высокий, заболевание не может быть однозначно отнесено к тяжелым, а также при рассмотрении возможности переноса аномального эмбриона. Этические аспекты ПГД рассмотрены с точки зрения базовых этических принципов: пользы и непричинения вреда, автономии, справедливости. В сравнении с пренатальной диагностикой, реализация этих принципов при ПГД сталкивается с рядом дополнительных сложных вопросов. Ценность эмбрионов человека, вероятность оставить супружескую пару без детей должны соотноситься с действительным риском и тяжестью возможного заболевания.

Геномная вариабельность является основой эволюции генома человека и включает в себя вариации последовательности ДНК и структурную вариабельность. К структурной вариабельности относят вариации числа копий участка ДНК (copy number variation - CNV), размером от 1000 п.н. до нескольких десятков млн п.н. Среди них выделяют субмикроскопические CNV размером от 1000 п.н. до 3 млн п.н., часть из которых является клинически значимой, то есть ассоциирована с задержкой психомоторного развития, врожденными пороками и/или аномалиями развития, а также заболеваниями аутистического спектра. Для анализа CNV используют широкий спектр методов с различной разрешающей способностью. В качестве универсального метода детекции субмикроскопических CNV в клинической практике используется хромосомный микроматричный анализ. Однако все чаще для анализа CNV используются методы высокопроизводительного секвенирования. Наряду с развитием полногеномных технологий, разрабатывается большое количество биоинформатических алгоритмов анализа CNV, имеющих разную эффективность. В связи с этим возрастает потребность в подтверждении полученных данных с целью исключения ложноположительных результатов. Кроме того, информации только о наличии или отсутствии CNV недостаточно для медико-генетического консультирования. Для оценки повторного риска хромосомной патологии необходимо определить структуру и происхождение обнаруженной CNV. С этой целью используются молекулярно-генетические и молекулярно-цитогенетические методы. Ряд молекулярно-генетических методов, основанных на использовании ПЦР, имеют разрешающую способность, достаточную для подтверждения субмикроскопических CNV. Молекулярно-цитогенетические методы включают в себя различные модификации метода флуоресцентной in situ гибридизации. Анализ субмикроскопических CNV с использованием FISH-метода ограничен длиной и спецификой фрагментов ДНК в зондах, используемых в традиционных протоколах исследования. Поэтому актуальным становится использование методов на основе in situ гибридизации с ДНК-зондами длиной порядка нескольких т.п.н., что позволяет не только подтвердить CNV и установить ее происхождение, но и определить структуру хромосомной перестройки, лежащей в основе хромосомного/геномного дисбаланса. В статье обсуждаются возможности, преимущества и недостатки различных методов, используемых для верификации клинически значимых CNV.

Неинвазивное пренатальное тестирование (НИПТ, Non-Invasive Prenatal Testing, NIPT) с целью выявления трисомий в последнее время получило широкое распространение в клинической практике во многих странах, включая Россию. Несмотря на то, что НИПТ не позволяет оценить количество и структуру всех хромосом плода (это возможно только путём кариотипирования), этот анализ обладает хорошими показателями чувствительности и специфичности, а также позволяет устранить риски, сопровождающие инвазивные диагностические процедуры (амниоцентез, кордоцентез, биопсия ворсин хориона и т.д.). Для НИПТ преимущественно используют последовательности внеклеточной фетальной ДНК (cell-free fetal DNA, cffDNA), которые в небольшой концентрации присутствуют в крови беременной женщины и исчезают после беременности. В настоящее время для НИПТ используют методы высокопроизводительного секвенирования (Next Generation Sequencing, NGS). В обзоре приведены основные подходы и методы, применяемые для НИПТ с целью обнаружения трисомий: массовое параллельное секвенирование методом дробовика (massive parallel shotgun sequencing, MPSS), таргетное массовое параллельное секвенирование (targeted massive parallel sequencing, t-MPS) и подходы, основанные на изучении однонуклеотидных полиморфизмов (single nucleotide polymorphism, SNP), а также произведено сравнение эффективности их использования для выявления трисомий по хромосомам 13, 18 и 21 (синдромов Патау, Эдвардса и Дауна, соответственно). При использовании MPSS анализу подвергаются последовательности всего генома, а при t-MPS - только специфические последовательности. В статье обсуждаются также методы анализа мРНК, эпигенетических маркёров плода и дополнительные методы усиления сигнала (например, DANSR, Digital Analysis of Selected Regions, цифровой анализ выбранных областей). В обзоре приведены основные причины появления ложных (ложноположительных и ложноотрицательных) результатов при НИПТ (мозаицизм, феномен “резорбция двойни”, низкий уровень cffDNA и др.). Дано краткое описание современного места НИПТ в клинической практике и перспектив включения НИПТ в схему пренатального скрининга, а также основных трудностей, ограничивающих более широкое применение технологии НИПТ в клинике. Прежде всего эти трудности связаны со спецификой cffDNA (концентрация, индивидуальные отличия и др.), а также с этическими аспектами (генетический детерминизм, информированное согласие пациентов и др.).

Актуальность: Ограниченный репродуктивный потенциал у человека и прогрессирующее ухудшение репродуктивного здоровья населения стали причиной развития вспомогательных репродуктивных технологий в последние десятилетия. С целью повышения вероятности имплантации бластоцисты, снижения частоты спонтанных абортов у семейных пар, которые имеют проблемы репродукции, в клиническую практику был введен преимплантационный генетический скрининг (ПГС). Культивирование эмбрионов человека in vitro в циклах экстракорпорального оплодотворении (ЭКО), а также возможность получения генетического материала при проведении ПГС позволяют оценить частоту и спектр хромосомных нарушений в бластоцистах человека. Цель: Анализ частоты и спектра числовых хромосомных аномалий в бластоцистах, полученных в рамках циклов ЭКО-ПГС. Материалы и методы. Проведен ретроспективный анализ молекулярных кариотипов 113 бластоцист, полученных в рамках циклов ЭКО-ПГС от 47 женщин. Полногеномная амплификация (ПГА) ДНК из клеток трофэктодермы проводилась с использованием набора реактивов PicoPlex (Rubicon Genomics, США). Анализ образцов ДНК, полученных после ПГА, был проведен методом микроматричной сравнительной геномной гибридизации (aCGH) с использованием микрочипа GenetiSure Pre-Screen, 8×60K (Agilent Technologies, США). Результаты: Эффективность ПГА составила 97,3% (110/113). Сбалансированный кариотип был установлен в 31% (34/110) бластоцист. Частота бластоцист с хромосомным дисбалансом в группе женщин моложе 35 лет оказалась значимо ниже (46,9 %) по сравнению с частотой бластоцист с хромосомным дисбалансом в группе женщин старше 35 лет (81,0 %) (р < 0,001). Хромосомные аномалии были представлены анеуплоидиями (74 %), в 26 % - структурными нарушениями хромосом. Распределение анеуплоидий имело следующую структуру: трисомии аутосом составили 41 %, моносомии аутосом - 48 %, анеуплоидии половых хромосом - 7%, тетрасомии аутосом - 3 %, нуллисомии аутосом - 1 %. Наиболее часто отмечались анеуплоидии хромосом 5, 15, 16, 17, 19, 21 и 22. Выводы: Анализ хромосомных аберраций в бластоцистах продемонстрировал высокую частоту хромосомного дисбаланса (69%) и широкий спектр как числовых, так и структурных нарушений хромосом. ПГС методом aCGH позволяет отобрать бластоцисты со сбалансированным набором хромосом. По результатам переносов бластоцист в циклах ЭКО-ПГС клиническая беременность наступила в 32% случаев.

В последнее время происходит активное внедрение высокоразрешающих методов диагностики для выявления хромосомных аномалий у человека. Так, использование микрочиповой диагностики (aCGH) позволяет выявлять хромосомные аномалии у 6 % плодов с нормальным кариотипом, определённым стандартными цитогенетическими методами. При этом для пренатальной диагностики aCGH используется в значительно меньших объемах. В первую очередь это обусловлено получением большого объема информации и сложностями её интерпретации. В настоящей работе приводятся результаты использования aCGH для пренатальной диагностики в НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ. Исследованы 44 образца плодного материала методом aCGH. В 20 случаях (45 %) идентифицирован геномный дисбаланс, сбалансированный кариотип был выявлен в 21 образце (48 %). В трех случаях (7 %) результат не был получен вследствие недостаточного количества или низкого качества биологического материала. Среди 20 случаев с хромосомными аномалиями было 4 образца с анеуплоидиями и 16 образцов с вариациями числа копий ДНК (CNV), из них 13 делеций и 10 дупликаций. Все CNV, выявленные в результате исследования, не представлены или представлены единичными случаями в базе данных DGV. По клинической значимости выявленные CNV распределились следующим образом: 5 аномалий с неясной клинической значимостью, 5 вероятно патогенных и 11 патогенных. Патогенные CNV были представлены 7 делециями и 4 дупликациями, идентифицированными в 10 образцах. Кроме «целевых» патогенных CNV, выявляются и так называемые случайные патогенетически значимые CNV. Случайные находки характерны для всех широкогогеномных и полногеномных исследований и вызывают сложности при медико-генетическом консультировании, связанные с информированием пациентов и возможным прерыванием беременности. В настоящем исследовании было выявлено по пять CNV (24 %), относящихся к группам случайных патогенных и с неясной клинической значимостью. Результаты настоящей работы свидетельствуют о необходимости использования современных молекулярно-цитогенетических методов для пренатальной диагностики хромосомных аномалий. При этом необходимо учитывать возникновение новых методических и этических вопросов, которые наиболее остро стоят при использовании этих методов в пренатальной диагностике.

Пренатальная диагностика хромосомных болезней в Томске и Томской области является неотъемлемой частью оказания медико-генетической помощи населению. В НИИ медицинской генетики внедрены эффективные методы хромосомного анализа практически на любом сроке беременности. За последние пять лет в клинико-диагностической лаборатории проведено 3503 пренатальных цитогенетических исследования, хромосомная патология выявлена в 300 случаях (8,5%). Наибольший процент хромосомной патологии отмечен в группе беременных после прохождения биохимического скрининга 1 триместра - 11,5%. При стандартном цитогенетическом исследовании исключается носительство анеуплоидий и полиплоидий, аномалий структуры хромосом, однако микроструктурные перестройки хромосом часто остаются не выявленными. Только применение комплексного молекулярно-цитогенетического обследования позволяет исключить хромосомную патологию с максимальной вероятностью.