ИНСТРУМЕНТЫ ГЕНОМНОЙ ИНЖЕНЕРИИ, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЕ ДЛЯ СОЗДАНИЯ ИЗОГЕННОЙ КЛЕТОЧНОЙ МОДЕЛИ БОКОВОГО АМИОТРОФИЧЕСКОГО СКЛЕРОЗА

Системы редактирования генома TALEN и CRISPR/Cas9 являются мощными инструментами для решения таких актуальных задач биомедицины, как создание клеточных моделей наследственных заболеваний человека и поиск средств их терапии. В данной работе нами были созданы и оптимизированы инструменты, которые предназначены для получения панели изогенных линий клеток, несущих мутации в гене SOD1, моделирующих наследственную форму бокового амиотрофического склероза (БАС). Для внесения двухцепочечных разрывов в восьми точках нуклеотидной последовательности гена SOD1 было создано 7 пар векторов, которые экспрессируют нуклеазы TALEN, и 8 векторов, экспрессирующих компоненты системы CRISPR/Cas9. Для внесения 11 однонуклеотидных замен, локализующихся вблизи двухцепочечных разрывов, был проведен дизайн донорных молекул — одноцепочечных ДНК-олигонукдеотидов. Показано, что все полученные системы проявляют активность в пределах этого гена, при этом CRISPR/Cas9 имеет более высокую активность по сравнению с TALEN во всех проанализированных точках. Для мутации Ala89Val показано, что использование одноцепочечного олигонуклеотида, модифицированного по концам фосфотиоатными связями, в качестве донорной молекулы повышает частоту гомологичной рекомбинации в месте разрыва.

1. Abel O., Powell J.F., Andersen P.M. et al. ALSoD: Auser-friendly online bioinformatics tool for amyotrophic lateral sclerosis genetics // Hum. Mutat. - 2012. - Vol. 33, №9. - P. 1345-1351.

2. Boch J., Scholze H., Schornack S. et al. Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors // Science. — 2009. - Vol. 326, №5959. - P. 1509-1512.

3. Boulting G.L., Kiskinis E., Croft G.F. et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells // Nat. Biotechnol. - 2011. - Vol. 29, №3. - P. 279-286.

4. Cermak T., Doyle E.L., Christian M. et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting // Nucleic Acids Res. - 2011. - Vol. 39, №12. - P. e82.

5. Chen H., Qian K., Du Z. et al. Modeling ALS with iPSCs reveals that mutant SOD1 misregulates neurofilament balance in motor neurons // Cell Stem Cell. - 2014. - Vol. 14, №6. -P. 796-809.

6. Cong L., Ran F.A., Cox D. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems // Science. - 2013. - Vol. 339, №6121. - P. 819-823.

7. Dianov G.L. and Hubscher U. Mammalian base excision repair: the forgotten archangel // Nucleic Acids Res. - 2013. -Vol. 41, №6. - P. 3483-3490.

8. Dimos J.T., Rodolfa K.T., Niakan K.K. et al. Induced pluri-potent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons // Science. - 2008. - Vol. 321, №5893. -P. 1218-1221.

9. Ding Q., Lee Y.K., Schaefer E.A. et al. A TALEN genome-editing system for generating human stem cell-based disease models // Cell Stem Cell. - 2013. - Vol. 12, №2. - P. 238-251.

10. Kim H., Um E., Cho S.R. et al. Surrogate reporters for enrichment of cells with nuclease-induced mutations // Nat. Methods. - 2011. - Vol. 8, №11. - P. 941-943.

11. Makarova K.S., Haft D.H., Barrangou R. et al. Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems // Nat. Rev. Microbiol. - 2011. - Vol. 9, №6. - P. 467-477.

12. Mali P., Yang L., Esvelt K.M. et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9 // Science. - 2013. - Vol. 339, №6121. - P. 823-826.

13. Martinez R.A., Stein J.L., Krostag A.R. et al. Genome engineering of isogenic human ES cells to model autism disorders // Nucleic Acids Res. - 2015. pii: gkv164

14. Miyaoka Y., Chan A.H., Judge L.M. et al. Isolation of single-base genome-edited human iPS cells without antibiotic selection // Nat. Methods. - 2014. - Vol. 11, №3. - P. 291-293.

15. Morbitzer R., Romer P., Boch J. et al. Regulation of selected genome loci using de novo-engineered transcription activator-like effector (TALE)-type transcription factors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2010. - Vol. 107, №50. - P. 21617-21622.

16. Moscou M.J. and Bogdanove A.J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors // Science. - 2009. - Vol. 326, №5959. - P. 1501.

17. Perez E.E., Wang J., Miller J.C. et al. Establishment of HIV-1 resistance in CD4+ T cells by genome editing using zinc-fin-ger nucleases // Nat. Biotechnol. - 2008. - Vol. 26, №7. -P. 808-816.

18. Ran F.A., Hsu P.D., Lin C.Y. et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity // Cell. - 2013. - Vol. 154, №6. - P. 1380-1389.

19. Ran F.A., Hsu P.D., Wright J. et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system // Nat. Protoc. - 2013. - Vol. 8, №11. - P. 2281-2308.

20. Romer P., Hahn S., Jordan T. et al. Plant pathogen recognition mediated by promoter activation of the pepper Bs3 resistance gene // Science. - 2007. - Vol. 318, №5850. - P. 645-648.

21. Rosen D.R. Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis // Nature. - 1993. - Vol. 364, №6435. - P. 362.

22. Saleh-Gohari N., Helleday T. Conservative homologous recombination preferentially repairs DNA double-strand breaks in the S phase of the cell cycle in human cells // Nucleic Acids Res. -2004. - Vol. 32, №12. - P. 3683-3688.

23. Sanjana N.E., Cong L., Zhou Y. et al. A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering // Nat. Protoc. — 2012. — Vol. 7, №1. — P. 171—192.

24. Soldner F., Laganiere J., Cheng A.W. et al. Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset Parkinson point mutations // Cell. — 2011. — Vol. 146, №2. — P. 318—331.

25. Wainger B.J., Kiskinis E., Mellin C. et al. Intrinsic membrane hyperexcitability of amyotrophic lateral sclerosis patient-derived motor neurons // Cell Rep. — 2014. — Vol. 7, №1. — P. 1—11.