Функциональное подтверждение патогенности варианта интронной последовательности гена PAX6

Врожденная аниридия (OMIM #106210) (ВА) - моногенный врожденный порок развития с аутосомно-доминантным типом наследования, встречающийся в популяции с частотой 1:45 000-1:100 000 населения. Ведущими диагностическими признаками являются врожденное отсутствие ткани радужки, гипоплазия центральной ямки и нистагм. Подавляющее большинство случаев ВА обусловлено гетерозиготными мутациями в гене PAX6 , расположенном в регионе 11р13, а также хромосомными перестройками, затрагивающими этот регион. Ранее в лаборатории генетической эпидемиологии проведен молекулярно-генетический анализ в группе из 110 больных из 84 неродственных семей с клиническим диагнозом врожденной аниридия из России, включавший секвенирование и анализ вариации числа копий генов в регионе 11р13. В общей сложности найден 81 вариант нуклеотидной последовательности, значительную часть которых (13,6%) составляют интронные мутации, локализующиеся как в канонических сайтах сплайсинга, так и глубоко в интронных областях (11 различных мутаций у 18 больных). Данные варианты нуклеотидной последовательности были проанализированы с использованием программ HSF v. 3.0 (Human Splicing Finder) и IntSplice. Их патогенный статус, как и других обнаруженных мутаций, устанавливался в соответствии с рекомендациями ACMG для интерпретации вариантов последовательностей ДНК. Настоящая работа посвящена доказательству влияния выявленного в спорадическом случае врожденной аниридии интронного варианта нуклеотидной последовательности с неизвестным клиническим значением NG_008679.1( PAX6 _v001):c.142-14C>G на паттерн сплайсинга. Функциональный анализ с использованием системы экспрессии минигенов in vitro показал, что данная замена ведет к возникновению нового акцепторного сайта сплайсинга интрона 5, в результате чего происходит удлинение экзона 6 на 13 нуклеотидов и сдвиг открытой рамки считывания (NM_000280.4( PAX6 _v001):c.141_142insTTCCCCTATGCAG, p.Val48PhefsTer12) с разрушением аберрантной мРНК по нонсенс-опосредованному механизму деградации (NMD). Таким образом, исследуемая интронная замена продуцирует нулевой аллель и ведет к гаплонедостаточности функции гена PAX6 , что приводит к развитию заболевания.

врожденная аниридия, гаплонедостаточность, PAX6, мутации, приводящие к нарушению сплайсинга, функциональный анализ, клонирование, система экспрессии минигенов in vitro, ОТ-ПЦР, HEK293, congenital aniridia, PAX6, haploinsufficiency, splicing mutations, variant of unknown clinical significance, functional evidence, cloning, in vitro mini-gene expression system, RT-PCR, HEK293

1. Васильева Т.А., Воскресенская А.А., Хлебникова О.В. и др. Дифференциальная диагностика наследственных форм врожденной аниридии с позиций современной генетики // Вестник РАМН. 2017. Т. 72. № 4. С. 233-241. doi: 10.15690/vramn834

2. Hingorani M., Hanson I., van Heyningen V. Aniridia // Eur J Hum Genet. 2012. V. 20. № 10. P. 1011-7. doi: 10.1038/ejhg.2012.100

3. Васильева Т.А., Хлебникова О.В., Марахонов А.В. и др. Изучение генетических основ и разработка протоколов для диагностики наследственных заболеваний органа зрения на примере врожденной аниридии // Медицинская генетика. 2016. Т. 15. № 6. С. 37-43.

4. Vasilyeva T.A., Voskresenskaya A.A., Kаsmann-Kellner B. et al. Molecular analysis of patients with aniridia in Russian Federation broadens the spectrum of PAX6 mutations // Clin Genet. 2017. V. 92. № 6. P. 639-644. doi: 10.1111/cge.13019

5. Richards S., Aziz N., Bale S. et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology // Genet Med. 2015. V. 17. № 5. P. 405-24. doi: 10.1038/gim.2015.30

6. Марахонов А.В., Васильева Т.А., Воскресенская А.А. и др. Опыт применения медицинской технологии диагностики врожденной аниридии в ФГБНУ «МГНЦ» // Медицинская генетика. 2017. Т. 16. № 11. С. 23-26.

7. Desmet F.O., Hamroun D., Lalande M. et al. Human Splicing Finder: an online bioinformatics tool to predict splicing signals // Nucleic Acids Res. 2009. V. 37. № 9. P. e67. doi: 10.1093/nar/gkp215

8. Shibata A., Okuno T., Rahman M.A. et al. IntSplice: prediction of the splicing consequences of intronic single-nucleotide variations in the human genome // J Hum Genet. 2016. V. 61. № 7. P. 633-40. doi: 10.1038/jhg.2016.23

9. Gurskaya N.G., Staroverov D.B., Zhang L. et al. Analysis of alternative splicing of cassette exons at single-cell level using two fluorescent proteins // Nucleic Acids Res. 2012. V. 40. № 8. P. e57. doi: 10.1093/nar/gkr1314

10. Sperling R. The nuts and bolts of the endogenous spliceosome // Wiley Interdiscip Rev RNA. 2017. V. 8. № 1 doi: 10.1002/wrna.1377

11. Liu S.R., Hu C.G., Zhang J.Z. Regulatory effects of cotranscriptional RNA structure formation and transitions // Wiley Interdiscip Rev RNA. 2016. V. 7. № 5. P. 562-74. doi: 10.1002/wrna.1350

12. Weisschuh N., Wissinger B., Gramer E. A splice site mutation in the PAX6 gene which induces exon skipping causes autosomal dominant inherited aniridia // Mol Vis. 2012. V. 18. P. 751-7.

13. Shoemaker C.J., Green R. Translation drives mRNA quality control // Nat Struct Mol Biol. 2012. V. 19. № 6. P. 594-601. doi: 10.1038/nsmb.2301

14. Denisov S.V., Bazykin G.A., Sutormin R. et al. Weak negative and positive selection and the drift load at splice sites // Genome Biol Evol. 2014. V. 6. № 6. P. 1437-47. doi: 10.1093/gbe/evu100