Использование Tn5 транспозозы для таргетного секвенирования ДНК

Актуальность. Внедрение технологий массового параллельного секвенирования (massively parallel sequencing, MPS) в клиническую практику требует разработки экономически эффективных и воспроизводимых протоколов пробоподготовки. Особый интерес представляет использование Tn5-транспозазы для подготовки ДНК-библиотек, позволяющей совместить фрагментацию ДНК и лигирование адаптеров в одной реакции, что сокращает время и количество необходимых этапов по сравнению со стандартными методами с ультразвуковой фрагментацией. Цель. Разработка протокола подготовки ДНК-библиотек на основе отечественной Tn5-транспозазы с последующим гибридизационным обогащением для таргетного секвенирования. Методы. Исследование проводили на геномной ДНК, выделенной из лейкоцитов периферической крови человека. Пре-библиотеки получали методом тагментации с использованием набора SyntEra-DNA на основе Tn5-транспозазы. Обогащение целевых регионов гена EGFR осуществляли путем двухраундовой гибридизации со специально подобранным пулом биотинилированных зондов с последующим захватом на стрептавидиновых магнитных частицах. Секвенирование обогащенных библиотек выполняли на платформе Illumina MiSeq. В качестве референсных технических данных использовали показатели секвенирования ранее полученных ДНК-библиотек, подготовленных с применением коммерческого набора SureSelectXT. Результаты и обсуждение. Разработанный протокол позволил получить ДНК-библиотеку со средней длиной фрагментов около 300 п.н. и концентрацией, достаточной для секвенирования. Доля целевых оснований гена EGFR с покрытием выше 10× достигала 98%, а доля с покрытием не менее 20× была 96%. Доля оснований, попавших в целевые регионы, составила 87%. Значение Fold-80 base penalty составило 1,5, что свидетельствует о равномерном покрытии целевой области. Выводы. Предложенный протокол на основе Tn5-транспозазы и отечественных реагентов позволил получить ДНК-библиотеку, пригодную для таргетного MPS, и подтверждает принципиальную применимость разработанного подхода для эффективного обогащения целевых регионов.

1. Donoghue M. T. A., Schram A. M., Hyman D. M., et al. Discovery through clinical sequencing in oncology // Nat Cancer. 2020. No 8. P. 774-783. doi: 10.1038/s43018-020-0100-0.

2. Karlovich C. A., Williams P. M. Clinical Applications of Next-Generation Sequencing in Precision Oncology // Cancer J. 2019. V. 25, No 4. P. 264-271. doi: 10.1097/PPO.0000000000000385.

3. Shi Z., Lopez J., Kalliney W., et al. Development and evaluation of ActSeq: A targeted next-generation sequencing panel for clinical oncology use // PLoS One. 2022. V. 17, No 4. P. e0266914. doi: 10.1371/journal.pone.0266914.

4. Rennert H., Eng K., Zhang T., et al. Development and validation of a whole-exome sequencing test for simultaneous detection of point mutations, indels and copy-number alterations for precision cancer care // NPJ Genom Med. 2016. V. 1. P. 16019. doi: 10.1038/npjgenmed.2016.19.

5. Lee Y. T., Tan Y. J., Oon C. E. Molecular targeted therapy: Treating cancer with specificity // Eur J Pharmacol. 2018. V. 834. P. 188-196. doi: 10.1016/j.ejphar.2018.07.034.

6. Rusch M., Nakitandwe J., Shurtleff S., et al. Clinical cancer genomic profiling by three-platform sequencing of whole genome, whole exome and transcriptome // Nat Commun. 2018. V. 9, No 1. P. 3962. doi: 10.1038/s41467-018-06485-7.

7. Nogrady B. How cancer genomics is transforming diagnosis and treatment // Nature. 2020. V. 579, No 7800. P. S10-S11. doi: 10.1038/d41586-020-00845-4.

8. Moorcraft S. Y., Gonzalez D., Walker B. A. Understanding next generation sequencing in oncology: A guide for oncologists // Crit Rev Oncol Hematol. 2015. V. 96, No 3. P. 463-74. doi: 10.1016/j.critrevonc.2015.06.007.

9. Kozarewa I., Armisen J., Gardner A. F., et al. Overview of Target Enrichment Strategies // Curr Protoc Mol Biol. 2015. V. 112. P. 7.21.1-7.21.23. doi: 10.1002/0471142727.mb0721s112.

10. Mamanova L., Coffey A. J., Scott C. E., et al. Target-enrichment strategies for next-generation sequencing // Nat Methods. 2010. V. 7, No 2. P. 111-8. doi: 10.1038/nmeth.1419.

11. Bewicke-Copley F., Arjun Kumar E., Palladino G., et al. Applications and analysis of targeted genomic sequencing in cancer studies // Comput Struct Biotechnol J. 2019. V. 17. P. 1348-1359. doi: 10.1016/j.csbj.2019.10.004.

12. Picelli S., Björklund A. K., Reinius B. Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaled sequencing projects // Genome Res. 2014. V. 24, No 12. P. 2033-40. doi: 10.1101/gr.177881.114.

13. Pei X. M., Yeung M. H. Y., Wong A. N. N., et al. Targeted Sequencing Approach and Its Clinical Applications for the Molecular Diagnosis of Human Diseases // Cells. 2023. V. 12, No 3. P. 493. doi: 10.3390/cells12030493.

14. Chen H., Yao J., Fu Y., et al. Tagmentation on Microbeads: Restore Long-Range DNA Sequence Information Using Next Generation Sequencing with Library Prepared by Surface-Immobilized Transposomes // ACS Appl Mater Interfaces. 2018. V. 10, No 14. P. 11539-11545. doi: 10.1021/acsami.8b01560.

15. Buenrostro J. D., Giresi P. G., Zaba L. C., et al. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position // Nat Methods. 2013. V. 10, No 12. P. 1213-8. doi: 10.1038/nmeth.2688.

16. Tan A. C., Tan D. S. W. Targeted Therapies for Lung Cancer Patients With Oncogenic Driver Molecular Alterations // J Clin Oncol. 2022. V. 40, No 6. P. 611-625. doi: 10.1200/JCO.21.01626.

17. Воробьёв Р. С., Замятин А. В., Геращенко Т. С. и др. Алгоритм высокопроизводительного обнаружения регионов низкой сложности в длинных геномных последовательностях // Вестник Томского государственного университета. Управление, вычислительная техника и информатика. 2025. № 72. С. 71-79. doi: 10.17223/19988605/72/7.