medgenМедицинская генетикаMedical Genetics2073-7998Publishing House «Genius Media» LLC10.25557/2073-7998.2026.09.48-55medgen-3571Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯORIGINAL RESEARCHИспользование Tn5 транспозозы для таргетного секвенирования ДНКUse of Tn5 transposase for targeted DNA sequencingЖигалинаД. И.ZhigalinaD. I.

Жигалина Д. И.

634009, г. Томск, пер. Кооперативный, д. 5

634050, г. Томск, Набережная реки Ушайки, д. 10

Zhigalina D. I.

darya.zhigalina@medgenetics.ruЖалсановаИ. Ж.ZhalsanovaI. Zh.

Жалсанова И. Ж.

634009, г. Томск, пер. Кооперативный, д. 5

634050, г. Томск, Набережная реки Ушайки, д. 10

Zhalsanova I. Zh. 

ВоробьёвР. С.VorobevR. S.

Воробьёв Р. С. 

634009, г. Томск, пер. Кооперативный, д. 5

Vorobev R. S. 

ГосударкинаС. Н.GosudarkinaS. N.

Государкина С. Н. 

634050, г. Томск, Набережная реки Ушайки, д. 10

Gosudarkina S. N. 

КафельниковаП. С.KafelnikovaP. S.

Кафельникова П. С. 

634050, г. Томск, Набережная реки Ушайки, д. 10

Kafelnikova P. S. 

КирееваТ. Н.KireevaT. N.

Киреева Т. Н. 

634050, г. Томск, Набережная реки Ушайки, д. 10

Kireeva T. N.

СкрябинН. А.SkryabinN. A.

Скрябин Н. А. 

634009, г. Томск, пер. Кооперативный, д. 5

634050, г. Томск, Набережная реки Ушайки, д. 10

Skryabin N. A. 

Научно-исследовательский институт онкологии, Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук; Научно-исследовательский институт медицинской генетики, Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наукРоссияCancer Research Institute, Tomsk National Research Medical Center, Russian Academy of Sciences; Research Institute of Medical Genetics, Tomsk National Research Medical Center, Russian Academy of SciencesRussian FederationНаучно-исследовательский институт онкологии, Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наукРоссияCancer Research Institute, Tomsk National Research Medical Center, Russian Academy of SciencesRussian FederationНаучно-исследовательский институт медицинской генетики, Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наукРоссияResearch Institute of Medical Genetics, Tomsk National Research Medical Center, Russian Academy of SciencesRussian Federation2026141020262594855Copyright © Жигалина Д.И., Жалсанова И.Ж., Воробьёв Р.С., Государкина С.Н., Кафельникова П.С., Киреева Т.Н., Скрябин Н.А., 20262026Жигалина Д.И., Жалсанова И.Ж., Воробьёв Р.С., Государкина С.Н., Кафельникова П.С., Киреева Т.Н., Скрябин Н.А.Zhigalina D.I., Zhalsanova I.Z., Vorobev R.S., Gosudarkina S.N., Kafelnikova P.S., Kireeva T.N., Skryabin N.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.medgen-journal.ru/jour/article/view/3571

Актуальность. Внедрение технологий массового параллельного секвенирования (massively parallel sequencing, MPS) в клиническую практику требует разработки экономически эффективных и воспроизводимых протоколов пробоподготовки. Особый интерес представляет использование Tn5-транспозазы для подготовки ДНК-библиотек, позволяющей совместить фрагментацию ДНК и лигирование адаптеров в одной реакции, что сокращает время и количество необходимых этапов по сравнению со стандартными методами с ультразвуковой фрагментацией. Цель. Разработка протокола подготовки ДНК-библиотек на основе отечественной Tn5-транспозазы с последующим гибридизационным обогащением для таргетного секвенирования. Методы. Исследование проводили на геномной ДНК, выделенной из лейкоцитов периферической крови человека. Пре-библиотеки получали методом тагментации с использованием набора SyntEra-DNA на основе Tn5-транспозазы. Обогащение целевых регионов гена EGFR осуществляли путем двухраундовой гибридизации со специально подобранным пулом биотинилированных зондов с последующим захватом на стрептавидиновых магнитных частицах. Секвенирование обогащенных библиотек выполняли на платформе Illumina MiSeq. В качестве референсных технических данных использовали показатели секвенирования ранее полученных ДНК-библиотек, подготовленных с применением коммерческого набора SureSelectXT. Результаты и обсуждение. Разработанный протокол позволил получить ДНК-библиотеку со средней длиной фрагментов около 300 п.н. и концентрацией, достаточной для секвенирования. Доля целевых оснований гена EGFR с покрытием выше 10× достигала 98%, а доля с покрытием не менее 20× была 96%. Доля оснований, попавших в целевые регионы, составила 87%. Значение Fold-80 base penalty составило 1,5, что свидетельствует о равномерном покрытии целевой области. Выводы. Предложенный протокол на основе Tn5-транспозазы и отечественных реагентов позволил получить ДНК-библиотеку, пригодную для таргетного MPS, и подтверждает принципиальную применимость разработанного подхода для эффективного обогащения целевых регионов.

Introduction. The introduction of massively parallel sequencing (MPS) technologies in clinical practice requires the development of cost-effective and reproducible sample preparation protocols. Particular interest is in the use of Tn5 transposase for tagmentation, which allows for the combination of DNA fragmentation and adapter ligation in a single reaction, reducing the time and number of steps compared to standard ultrasonic fragmentation methods. Aim: to develop a protocol for preparing DNA libraries using domestically produced Tn5 Transposase, followed by hybridization enrichment for targeted sequencing. Methods. The study was performed on genomic DNA isolated from human peripheral blood leukocytes. Pre-libraries were generated by tagmentation using the SyntEra-DNA kit based on Tn5 transposase. Enrichment of target regions of the EGFR gene was achieved by two-round hybridization with a specially selected pool of biotinylated probes, followed by capture on streptavidin magnetic particles. Sequencing of the enriched libraries was performed on the Illumina MiSeq platform. Sequencing metrics from previously obtained DNA libraries prepared using the commercial SureSelectXT kit were used as a reference sequencing metrics. Results. The developed protocol enabled the generation of a DNA library with an average fragment length of approximately 300 bp and a concentration sufficient for sequencing. The proportion of base mapped to EGFR target regions with coverage of at least 10× was 98%, and the proportion with coverage of at least 20× was 96%. The proportion of bases mapped to EGFR target regions was 87%. The Fold-80 base penalty was 1.5, indicating uniform coverage across the target region. Conclusions. The proposed protocol, based on Tn5 transposase and domestic reagents, allowed us to create a DNA library that is suitable for targeted MPS analysis and confirms the fundamental applicability of the developed approach for the effective enrichment of target regions.

Tn5 транспозазатагментацияДНК-библиотекатаргетное секвенированиемассовое параллельное секвенированиеонкологияTn5 transposasetagmentationDNA librarytargeted sequencingmassively parallel sequencingoncologyИсследование выполнено в рамках государственного задания Министерства науки и высшего образования РФ № 075-00490-25-04 (Регистрационный номер темы 125042105351-1) и при использовании оборудования Центра коллективного пользования «Медицинская геномика» Томского НИМЦ.The work is supported by the Ministry of Education and Science of the Russian Federation, budget classification code: 075-00490-25-04. Scientific topic code: 125042105351-3. The study was performed using the equipment of the Center for Collective Use "Medical Genomics" of the Tomsk National Research Medical Center.ReferencesDonoghue M. T. A., Schram A. M., Hyman D. M., et al. Discovery through clinical sequencing in oncology // Nat Cancer. 2020. No 8. P. 774-783. doi: 10.1038/s43018-020-0100-0.Donoghue M. T. A., Schram A. M., Hyman D. M., et al. Discovery through clinical sequencing in oncology. Nat Cancer, 2020, no. 8, pp. 774-783. doi: 10.1038/s43018-020-0100-0.Karlovich C. A., Williams P. M. Clinical Applications of Next-Generation Sequencing in Precision Oncology // Cancer J. 2019. V. 25, No 4. P. 264-271. doi: 10.1097/PPO.0000000000000385.Karlovich C. A., Williams P. M. Clinical Applications of Next-Generation Sequencing in Precision Oncology. Cancer J., 2019, vol. 25, no. 4, pp. 264-271. doi: 10.1097/PPO.0000000000000385.Shi Z., Lopez J., Kalliney W., et al. Development and evaluation of ActSeq: A targeted next-generation sequencing panel for clinical oncology use // PLoS One. 2022. V. 17, No 4. P. e0266914. doi: 10.1371/journal.pone.0266914.Shi Z., Lopez J., Kalliney W., et al. Development and evaluation of ActSeq: A targeted next-generation sequencing panel for clinical oncology use. PLoS One, 2022, vol. 17, no. 4, p. e0266914. doi: 10.1371/journal.pone.0266914.Rennert H., Eng K., Zhang T., et al. Development and validation of a whole-exome sequencing test for simultaneous detection of point mutations, indels and copy-number alterations for precision cancer care // NPJ Genom Med. 2016. V. 1. P. 16019. doi: 10.1038/npjgenmed.2016.19.Rennert H., Eng K., Zhang T., et al. Development and validation of a whole-exome sequencing test for simultaneous detection of point mutations, indels and copy-number alterations for precision cancer care. NPJ Genom Med., 2016, vol. 1, p. 16019. doi: 10.1038/npjgenmed.2016.19.Lee Y. T., Tan Y. J., Oon C. E. Molecular targeted therapy: Treating cancer with specificity // Eur J Pharmacol. 2018. V. 834. P. 188-196. doi: 10.1016/j.ejphar.2018.07.034.Lee Y. T., Tan Y. J., Oon C. E. Molecular targeted therapy: Treating cancer with specificity. Eur J Pharmacol., 2018, vol. 834, pp. 188-196. doi: 10.1016/j.ejphar.2018.07.034.Rusch M., Nakitandwe J., Shurtleff S., et al. Clinical cancer genomic profiling by three-platform sequencing of whole genome, whole exome and transcriptome // Nat Commun. 2018. V. 9, No 1. P. 3962. doi: 10.1038/s41467-018-06485-7.Rusch M., Nakitandwe J., Shurtleff S., et al. Clinical cancer genomic profiling by three-platform sequencing of whole genome, whole exome and transcriptome. Nat Commun., 2018, vol. 9, no. 1, p. 3962. doi: 10.1038/s41467-018-06485-7.Nogrady B. How cancer genomics is transforming diagnosis and treatment // Nature. 2020. V. 579, No 7800. P. S10-S11. doi: 10.1038/d41586-020-00845-4.Nogrady B. How cancer genomics is transforming diagnosis and treatment. Nature, 2020, vol. 579, no. 7800, pp. S10-S11. doi: 10.1038/d41586-020-00845-4.Moorcraft S. Y., Gonzalez D., Walker B. A. Understanding next generation sequencing in oncology: A guide for oncologists // Crit Rev Oncol Hematol. 2015. V. 96, No 3. P. 463-74. doi: 10.1016/j.critrevonc.2015.06.007.Moorcraft S. Y., Gonzalez D., Walker B. A. Understanding next generation sequencing in oncology: A guide for oncologists. Crit Rev Oncol Hematol., 2015, vol. 96, no. 3, pp. 463-74. doi: 10.1016/j.critrevonc.2015.06.007.Kozarewa I., Armisen J., Gardner A. F., et al. Overview of Target Enrichment Strategies // Curr Protoc Mol Biol. 2015. V. 112. P. 7.21.1-7.21.23. doi: 10.1002/0471142727.mb0721s112.Kozarewa I., Armisen J., Gardner A. F., et al. Overview of Target Enrichment Strategies. Curr Protoc Mol Biol., 2015, vol. 112, pp. 7.21.1-7.21.23. doi: 10.1002/0471142727.mb0721s112.Mamanova L., Coffey A. J., Scott C. E., et al. Target-enrichment strategies for next-generation sequencing // Nat Methods. 2010. V. 7, No 2. P. 111-8. doi: 10.1038/nmeth.1419.Mamanova L., Coffey A. J., Scott C. E., et al. Target-enrichment strategies for next-generation sequencing. Nat Methods, 2010, vol. 7, no. 2, pp. 111-8. doi: 10.1038/nmeth.1419.Bewicke-Copley F., Arjun Kumar E., Palladino G., et al. Applications and analysis of targeted genomic sequencing in cancer studies // Comput Struct Biotechnol J. 2019. V. 17. P. 1348-1359. doi: 10.1016/j.csbj.2019.10.004.Bewicke-Copley F., Arjun Kumar E., Palladino G., et al. Applications and analysis of targeted genomic sequencing in cancer studies. Comput Struct Biotechnol J., 2019, vol. 17, pp. 1348-1359. doi: 10.1016/j.csbj.2019.10.004.Picelli S., Björklund A. K., Reinius B. Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaled sequencing projects // Genome Res. 2014. V. 24, No 12. P. 2033-40. doi: 10.1101/gr.177881.114.Picelli S., Björklund A. K., Reinius B. Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaled sequencing projects. Genome Res., 2014, vol. 24, no. 12, pp. 2033-40. doi: 10.1101/gr.177881.114.Pei X. M., Yeung M. H. Y., Wong A. N. N., et al. Targeted Sequencing Approach and Its Clinical Applications for the Molecular Diagnosis of Human Diseases // Cells. 2023. V. 12, No 3. P. 493. doi: 10.3390/cells12030493.Pei X. M., Yeung M. H. Y., Wong A. N. N., et al. Targeted Sequencing Approach and Its Clinical Applications for the Molecular Diagnosis of Human Diseases. Cells, 2023, vol. 12, no. 3, p. 493. doi: 10.3390/cells12030493.Chen H., Yao J., Fu Y., et al. Tagmentation on Microbeads: Restore Long-Range DNA Sequence Information Using Next Generation Sequencing with Library Prepared by Surface-Immobilized Transposomes // ACS Appl Mater Interfaces. 2018. V. 10, No 14. P. 11539-11545. doi: 10.1021/acsami.8b01560.Chen H., Yao J., Fu Y., et al. Tagmentation on Microbeads: Restore Long-Range DNA Sequence Information Using Next Generation Sequencing with Library Prepared by Surface-Immobilized Transposomes. ACS Appl Mater Interfaces, 2018, vol. 10, no. 14, pp. 11539-11545. doi: 10.1021/acsami.8b01560.Buenrostro J. D., Giresi P. G., Zaba L. C., et al. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position // Nat Methods. 2013. V. 10, No 12. P. 1213-8. doi: 10.1038/nmeth.2688.Buenrostro J. D., Giresi P. G., Zaba L. C., et al. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat Methods, 2013, vol. 10, no. 12, pp. 1213-8. doi: 10.1038/nmeth.2688.Tan A. C., Tan D. S. W. Targeted Therapies for Lung Cancer Patients With Oncogenic Driver Molecular Alterations // J Clin Oncol. 2022. V. 40, No 6. P. 611-625. doi: 10.1200/JCO.21.01626.Tan A. C., Tan D. S. W. Targeted Therapies for Lung Cancer Patients With Oncogenic Driver Molecular Alterations. J Clin Oncol., 2022, vol. 40, no. 6, pp. 611-625. doi: 10.1200/JCO.21.01626.Воробьёв Р. С., Замятин А. В., Геращенко Т. С. и др. Алгоритм высокопроизводительного обнаружения регионов низкой сложности в длинных геномных последовательностях // Вестник Томского государственного университета. Управление, вычислительная техника и информатика. 2025. № 72. С. 71-79. doi: 10.17223/19988605/72/7.Vorobev R. S., Zamyatin A. V., Gerashchenko T. S., et al. A high-performance algorithm for detecting low-complexity regions in long genomic sequences. Vestnik Tomskogo gosudarstvennogo universiteta. Upravlenie, vychislitelnaja tehnika i informatika – Tomsk State University Journal of Control and Computer Science, 2025, no. 72, pp. 71–79. (In Russian). doi: 10.17223/19988605/72/7.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.