Пропуск экзонов 11 и 12 гена DMD для лечения миодистрофии Дюшенна.

Миодистрофия Дюшенна (МДД) – тяжелое, рецессивное Х-сцепленное заболевание, развивающееся из-за патогенных вариантов в гене DMD. Нонсенс-замены и варианты, сопровождающиеся сдвигом рамки считывания, зачастую приводят к более тяжелому фенотипу – МДД, тогда как варианты, не приводящие к сдвигу рамки считывания, позволяют клетке производить укороченный, но частично функциональный дистрофин, что обусловливает более легкий фенотип – миодистрофию Беккера. Основной терапевтической стратегией МДД является восстановление рамки считывания и достижение Беккер-подобного фенотипа. Целью настоящей работы явилось разрушение сайтов сплайсинга экзонов 11 и 12 в гене DMD для восстановления рамки считывания с использованием CRISPR-Cas при МДД. Были подобраны шесть гидовых РНК (гРНК) для нуклеаз SpCas9 и SaCas9. На первом этапе проведен их скрининг в линии HEK293T, по результатам которого было отобрано три гРНК на экзон 11 и одна – на экзон 12. Эксперименты в миобластах пациента с МДД с делецией 12-18 экзонов DMD показали, что эффективность пропуска экзона 11 низкая и обусловлена внесением протяженных делеций в область канонического сайта сплайсинга. Эффективность пропуска экзона 12 гена DMD в иммортализованных миобластах здорового донора в среднем составила 9,2% аллелей. Следует продолжить исследования по пропуску экзона 12 гена DMD в пациент-специфичных клетках для доказательства восстановления продукции белка дистрофина.

1. Moat S.J., Bradley D.M., Salmon R., et al. Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy: 21 years experience in Wales (UK). Eur J Hum Genet. 2013; 21: 1049–1053.

2. Pikó H., Vancsó V., Nagy B., et al. Dystrophin gene analysis in Hungarian Duchenne/Becker muscular dystrophy families detection of carrier status in symptomatic and asymptomatic female relatives. Neuromuscul Disord. 2009; 19: 108–112.

3. Hoffman E.P., Brown R.H., Kunkel LM. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell 1987; 51: 919–928.

4. Muntoni F., Torelli S., Ferlini A. Dystrophin and mutations: one gene, several proteins, multiple phenotypes. Lancet Neurol. 2003; 2: 731–740.

5. Meyers T.A., Townsend D. Cardiac Pathophysiology and the Future of Cardiac Therapies in Duchenne Muscular Dystrophy. Int J Mol Sci. 2019; 20: 4098.

6. Chang M., Cai Y., Gao Z. et al. Duchenne muscular dystrophy: pathogenesis and promising therapies. J Neurol. 2023; 270: 3733–3749.

7. Wood S.J., Slater C.R. Safety factor at the neuromuscular junction. Prog Neurobiol. 2001; 64: 393–429.

8. Prins K.W., Humston J.L., Mehta A., et al. Dystrophin is a microtubule-associated protein. J Cell Biol. 2009; 186: 363–369.

9. Chang N.C., Sincennes M.-C., Chevalier F.P. et al. The Dystrophin Glycoprotein Complex Regulates the Epigenetic Activation of Muscle Stem Cell Commitment. Cell Stem Cell. 2018; 22: 755-768.e6.

10. Blake D.J., Weir A., Newey S.E., Davies K.E. Function and genetics of dystrophin and dystrophin-related proteins in muscle. Physiol Rev. 2002; 82: 291–329.

11. Bladen C.L., Salgado D., Monges S. et al. The TREAT-NMD DMD Global Database: analysis of more than 7,000 Duchenne muscular dystrophy mutations. Hum Mutat. 2015; 36: 395–402.

12. Monaco A.P., Bertelson C.J., Liechti-Gallati S., et al. An explanation for the phenotypic differences between patients bearing partial deletions of the DMD locus. Genomics. 1988; 2: 90–95.

13. Arechavala-Gomeza V., Graham I.R., Popplewell L.J. et al. Comparative analysis of antisense oligonucleotide sequences for targeted skip ping of exon 51 during dystrophin pre-mRNA splicing in human muscle. Hum Gene Ther. 2007; 18: 798–810.

14. Clemens P.R., Rao V.K., Connolly A.M. et al. Safety, Tolerability, and Efficacy of Viltolarsen in Boys With Duchenne Muscular Dystrophy Amenable to Exon 53 Skipping: A Phase 2 Randomized Clinical Tri al. JAMA Neurol. 2020; 77: 982–991.

15. Frank D.E., Schnell F.J., Akana C. et al. Increased dystrophin production with golodirsen in patients with Duchenne muscular dystrophy. Neurology. 2020; 94: e2270–e2282.

16. Aartsma-Rus A., De Waele L., Houwen-Opstal S. et al. The Dilem ma of Choice for Duchenne Patients Eligible for Exon 51 Skipping The European Experience. J Neuromuscul Dis. 2023; 10: 315–325.

17. Ousterout D.G., Kabadi A.M., Thakore P.I., et al. Multiplex CRIS PR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy. Nat Commun. 2015; 6: 6244.

18. Maggio I., Liu J., Janssen J.M., et al. Adenoviral vectors encoding CRISPR/Cas9 multiplexes rescue dystrophin synthesis in unselected populations of DMD muscle cells. Sci Rep. 2016; 6: 37051.

19. Amoasii L., Long C., Li H. et al. Single-cut genome editing restores dystrophin expression in a new mouse model of muscular dystrophy. Sci Transl Med. 2017; 9: eaan8081.

20. Amoasii L., Hildyard J.C.W., Li H. et al. Gene editing restores dys trophin expression in a canine model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 2018; 362: 86–91.

21. Guo X., Dai Y., Cui L., Fang Q. A novel dystrophin deletion mutation in a becker muscular dystrophy patient with early-onset dilated cardiomyopathy. Can J Cardiol. 2014; 30: 956.e1–3.

22. Levchenko O., Panchuk I., Kochergin-Nikitsky K. et al. Unexpected extra exon skipping in the DYSF gene during restoring the reading frame by CRISPR/Cas9. Biosystems. 2024; 235: 105072.

23. van Putten M., van der Pijl E.M., Hulsker M. et al. Low dystrophin levels in heart can delay heart failure in mdx mice. J Mol Cell Cardiol. 2014; 69: 17–23.

24. Aartsma-Rus A., Krieg A.M. FDA Approves Eteplirsen for Duchenne Muscular Dystrophy: The Next Chapter in the Eteplirsen Saga. Nucleic Acid Ther. 2017; 27: 1–3