Медицинская ДНК-технология оценки чувствительности опухолей молочной железы люминального В подтипа к неоадъювантной химиотерапии с применением антрациклинов на основе маркеров метилирования ДНК

Цель. Разработать ДНК-технологию прогноза эффективности неоадъювантной химиотерапии (НАХТ) рака молочной железы (РМЖ) на основе определения состояния метилирования ограниченного набора маркеров метилирования ДНК методом многолокусной метилчувствительной полимеразной цепной реакции (МЧ-ПЦР). Задачи. (1) Провести широкогеномный анализ метилирования ДНК из биоптатов опухолей молочной железы до проведения НАХТ с применением антрациклинов. (2) Сформировать ограниченную панель маркеров метилирования ДНК, наиболее информативных с точки зрения прогноза эффективности НАХТ. (3) Разработать и оптимизировать лабораторный протокол многолокусной МЧ-ПЦР для определения статуса метилирования маркеров разработанной панели. (4) Оценить диагностические свойства полученной панели маркеров метилирования ДНК. Материалы и методы. Методом XmaI-RRBS проведён широкогеномный анализ 27 биопсийных образцов РМЖ люминального B подтипа, взятых до лечения под контролем УЗИ. По результатам XmaI-RRBS выбраны 10 генов, состояние метилирования промоторов которых наиболее эффективно маркирует эпигенетические подтипы опухолей с разным ответом на НАХТ. Состояние метилирования выбранных маркеров определяли методом МЧ-ПЦР с тремя пулами праймеров в выборке из 40 образцов ДНК биопсийных образцов РМЖ люминального B подтипа, взятых до лечения. Оценку диагностических свойств системы проводили методом ROC-анализа. Результаты. По данным широкогеномного анализа метилирования ДНК в качестве наиболее информативных маркеров чувствительности РМЖ к НАХТ с использованием антрациклинов определили участки генов SLC9A3, C1QL2, DPYS, IRF4, ADCY8, KCNQ2, TERT, SYNDIG1, SKOR2 и GRIK1 . Для проведения локус-специфического тестирования состояния метилирования этих маркеров разработали систему многолокусной МЧ-ПЦР. По результатам локус-специфического тестирования определили диагностические свойства системы: площадь под ROC-кривой составила 84%, чувствительность системы - 82% при специфичности 80%, точность - 82%. Выводы. Система, включающая ограниченное количество маркеров метилирования ДНК, позволяет эффективно прогнозировать ответ опухоли молочной железы люминального В подтипа на НАХТ с использованием антрациклинов по результатам анализа биопсийного материала, полученного до начала лечения.

рак молочной железы, неоадъювантная химиотерапия, широкогеномный анализ метилирования ДНК, многолокусная метилчувствительная ПЦР, Breast cancer, neoadjuvant chemotherapy, genome wide analysis of DNA methylation, multilocus methylation sensitive restriction enzyme PCR

1. Kaufmann M., von Minckwitz G., Mamounas E.P., et al. Recommendations from an international consensus conference on the current status and future of neoadjuvant systemic therapy in primary breast cancer. Ann Surg Oncol. 2012; 19(5): 1508-1516.

2. Litviakov N.V., Cherdyntseva N.V., Tsyganov M.M., Slonimskaya Е.M., Ibragimova M.K., Kazantseva P.V., Kzhyshkowska Julia, Choinzonov E.L. Deletions of multidrug resistance gene loci in breast cancer leads to the down-regulation of its expression and predict tumor response to neoadjuvant chemotherapy. Oncotarget. 2016; 7(7): 7829-7841.

3. Казанцева П.В., Цыганов М.М., Слонимская Е.М., Литвяков Н.В., Чердынцева Н.В., Ибрагимова М.К., Дорошенко А.В., Тарабановская Н.А., Паталяк С.В. Молекулярно-генетические маркеры эффективности неоадъювантной химиотерапии с применением антрациклинов у больных раком молочной железы. Сибирский онкологический журнал. 2016; 15(2): 29-35.

4. М.М. Цыганов, А.Г. Щербакова Метилирование промоторов генов множественной лекарственной устойчивости в опухолевой ткани молочной железы и эффект неоадъювантной химиотерапии. Сибирский онкологический журнал. 2012; 172-173

5. Стрельников В.В. Основные направления молекулярно-генетических исследований в онкологии // Медицинская генетика. - 2012. - №10

6. Aubele M. et al. The Predictive Value of PITX2 DNA Methylation for High-Risk Breast Cancer Therapy: Current Guidelines, Medical Needs, and Challenges //Disease Markers. - 2017. - Т. 2017.

7. Akiyama Y. et al. GATA-4 and GATA-5 transcription factor genes and potential downstream antitumor target genes are epigenetically silenced in colorectal and gastric cancer //Molecular and cellular biology. - 2003. - Т. 23. - №. 23. - С. 8429-8439.

8. Cancer Genome Atlas Network Et al. Comprehensive molecular portraits of human breast tumors. Nature. 2012; 490(7418): 61-70

9. Tanas A.S., Borisova M.E., Kuznetsova E.B., Rudenko V.V., Karandasheva K.O., Nemtsova M.V., Izhevskaya V.L., Simonova O.A., Larin S.S., Zaletaev D.V., Strelnikov V.V. Rapid and Affordable Genome-Wide Bisulfite DNA Sequencing by XmaI-reduced Representation Bisulfite Sequencing. Epigenomics. 2017; 9(6): 833-847.

10. Стрельников В.В., Танас А.С., Руденко В.В., Кузнецова Е.Б., Залетаев Д.В. Геномный анализ метилирования ДНК с использованием секвенирования нового поколения. Медицинская генетика. 2014; 13(3): 32-37.

11. Танас А.С., Кузнецова Е.Б., Борисова М.Э., Руденко В.В., Залетаев Д.В., Стрельников В.В. Дизайн метода бисульфитного секвенирования ограниченных наборов геномных локусов (RRBS) для анализа метилирования CpG-островков человека в больших выборках. Молекулярная биология. 2015; 49(4): 689-699.

12. Raizis A. M., Schmitt F., Jost J. P. A bisulfite method of 5-methylcytosine mapping that minimizes template degradation. Analytical biochemistry. 1995; 226(1): 161-166.

13. Olova N., Krueger F., Andrews S., Oxley D.O., Branco M.R., Reik W. Comparison of whole-genome bisulfite sequencing library preparation strategies identifies sources of biases affecting DNA methylation data. bioRxiv. 2017: 165449.

14. Melnikov A.A., Gartenhaus R.B., Levenson A.S., Motchoulskaia N.A., Levenson V.V. MSRE-PCR for analysis of gene-specific DNA methylation. Nucleic acids research. 2005; 33(10): e93.

15. Стрельников В.В., Танас А.С., Кузнецова Е.Б. Методология локус-специфического анализа метилирования ДНК. Издательство: LAP Lambert Academic Publishing. ISBN 9783659670411; 2014; 104 С.