Анализ экспрессии генов и цифровое кариотипирование бластоцист человека по результатам полнотранскриптомного секвенирования

Введение. Изучение раннего эмбриогенеза человека сопряжено с анализом ограниченного количества биологического материала. Большинство методических подходов не дает возможности одновременно проанализировать несколько характеристик бластоцист на одном и том же материале. В данной работе представлены результаты пилотного исследования по секвенированию РНК клеток внутренней клеточной массы (ВКМ) и трофэктодермы (ТЭ) бластоцист человека.

Цель: оценка возможности анализа экспрессии генов и реконструкции кариотипов бластоцист с использованием данных полнотранскриптомного секвенирования.

Методы. Материал – 16 бластоцист человека, которые были получены в рамках циклов экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) в ОГАУЗ «Областной перинатальный центр им. И.Д. Евтушенко». Бластоцисты были механически разделены на ВКМ (2 фрагмента) и ТЭ (3 фрагмента). Пробоподготовка библиотек для секвенирования РНК проводилась с помощью коммерческого набора QIAseq FX Single Cell RNA Library Kit (Qiagen, Germany). Секвенирование было произведено на приборе NextSeq 550 с использованием коммерческих наборов NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 sequencing kit и NextSeq 500/550 High Output Kit v2 kit (Illumina, США), а также на приборе NextSeq 2000 (Illumina, США) с использованием коммерческого набора NextSeq 2000 P3 reagents (300 cycles) (Illumina, США). Биоинформатическая обработка данных проводилась с использованием FastQC, multiQC, STAR, R, DESeq2, superFreq. Для реконструкции цифровых кариотипов исследуемых образцов в качестве референсных образцов с подтвержденным нормальным кариотипом были использованы эмбриоидные тельца (ЭТ), полученные из линий индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК).

 Результаты. В бластоцистах 7 дня развития в сравнении с бластоцистами 5 дня (7vs5) была выделена группа генов, ответственных за рост бластоцист (CTR9, GINS1 и ZNF830). При сравнении 7vs5 и при сравнении 6vs5 было выделено несколько групп генов, ответственных за локализацию белков и трансляцию. Всего выявлено 286 признаков хромосомной нестабильности (signatures of chromosomal instability, CIN). Амплификации, делеции, частичные амплификации и делеции аутосом встречались с частотой 48,3%, 34,3%, 11,2% и 6,3%, соответственно. Наиболее часто выявлялись нарушения числа копий 3, 5, 9, 10, 12, 15, 16, 17, 19, 22 хромосом. Нами была обнаружена обратная статистически значимая корреляция между качеством ТЭ и числом CIN в ВКМ, а также тенденция к уменьшению CIN в ТЭ при изменении качества ТЭ от «C» к «A».

Заключение. Реконструкция кариотипов бластоцист на основе данных полнотранскриптомного анализа возможна и представляет интерес с точки зрения изучения взаимосвязи экспрессионных профилей клеток бластоцист и их хромосомной конституции.

1. Shaw L., Sneddon S.F., Zeef L., et al. Global gene expression profiling of individual human oocytes and embryos demonstrates heterogeneity in early development. Plos One. 2013;8(5):e64192.

2. Rossant J., Tam P.P. Early human embryonic development: Blastocyst formation to gastrulation. Dev Cell. 2022;57(2):152-165.

3. Alfarawati S., Fragouli E., Colls P., et al. The relationship between blastocyst morphology, chromosomal abnormality, and embryo gender. Fertil Steril. 2011;95(2):520-524.

4. Schoolcraft W.B., Gardner D.K., Lane M., et al. Blastocyst culture and transfer: analysis of results and parameters affecting outcome in two in vitro fertilization programs. Fertil Steril. 1999;72(4):604-609.

5. Andrews S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. 2010. [Electronic resource] Available at: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc. Accessed: 20.10.2024.

6. Ewels P., Magnusson M., Lundin S., et al. MultiQC: summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 2016;32(19):3047-3048.

7. Dobin A., Davis C.A., Schlesinger F., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 2013;29(1):15-21.

8. Liao Y., Smyth G.K., Shi W. featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 2014;30(7):923-930.

9. Groff A.F., Resetkova N., DiDomenico F., et al. RNA-seq as a tool for evaluating human embryo competence. Genome Res. 2019;29(10):1705-1718.

10. Love M., Anders S., Huber W. Differential analysis of count data– the DESeq2 package. Genome Biol. 2014;15(550):10-1186.

11. Zhu A. Statistical methods for sequencing count data and integrative functional genomics. 2019. [Electronic resource] Available at: https://doi.org/10.17615/y2et-dh46. Accessed: 20.10.2024.

12. Flensburg C., Sargeant T., Oshlack A., et al. SuperFreq: Integrated mutation detection and clonal tracking in cancer. PLoS Comput Biol. 2020;16(2):e1007603.

13. Malakhova A.A., Grigor’eva E.V., Pavlova S.V., et al. Generation of induced pluripotent stem cell lines ICGi021-A and ICGi022-A from peripheral blood mononuclear cells of two healthy individuals from Siberian population. Stem Cell Res. 2020a;48:101952.

14. Malakhova A.A., Grigor’eva E.V., Vasilyeva O.Y., et al. Generation of two induced pluripotent stem cell lines from peripheral blood mononuclear cells of a patient with Wilson’s disease. Stem Cell Res. 2020b;47:101922.

15. Zhigalina D.I., Malakhova A.A., Vasilyeva O.Y., et al. Generation of an induced pluripotent stem cell line ICGi030-A from a Wilson’s disease patient carrying a frameshift mutation p. Lys1013fs and missense mutation p. H1069Q in the ATP7B gene. Stem Cell Res. 2021;57:102556.

16. Zhang K., Haversat J.M., Mager J. CTR9/PAF1c regulates molecular lineage identity, histone H3K36 trimethylation and genomic imprinting during preimplantation development. Dev Biol. 2013;383(1):15-27.

17. Genuth N.R., Shi Z., Kunimoto K., et al. A stem cell roadmap of ribosome heterogeneity reveals a function for RPL10A in mesoderm production. Nat Commun. 2022;13(1):5491.

18. Tranguch S., Chakrabarty A., Guo Y., et al. Maternal pentraxin 3 deficiency compromises implantation in mice. Biol Reprod. 2007;77(3):425-432.

19. Huang K., Maruyama T., Fan G. The naive state of human pluripotent stem cells: a synthesis of stem cell and preimplantation embryo transcriptome analyses. Cell Stem Cell. 2014;15(4):410-415.

20. Franasiak J.M., Forman E.J., Hong K.H., et al. Aneuploidy across individual chromosomes at the embryonic level in trophectoderm biopsies: changes with patient age and chromosome structure. J Assist Reprod Genet. 2014;31:1501-1509.