Молекулярно-генетическая диагностика мозаичных форм заболеваний с использованием дуплекс-специфической нуклеазы на примере PIK3CA-ассоциированного спектра заболеваний избыточного роста

Введение. Обнаружение интересующих генетических вариантов при мозаичных формах заболеваний может быть существенно осложнено малой представленностью таковых в биологическом материале, взятом для анализа. Существует широкий спектр методологических подходов для выявления редких генетических вариантов в клинико-лабораторной диагностике, однако не все они могут быть доступны для многих лабораторий из-за различных ограничений. Метод с применением дуплекс-специфической нуклеазы (ДСН) с последующим секвенированием по Сэнгеру нацелен на обнаружение низкопредставленных однонуклеотидных генетических вариантов практически в любой точке генома.

Цель: усовершенствование метода молекулярно-генетической диагностики мозаичных форм генетических заболеваний с применением ДСН на примере PIK3CA-ассоциированного спектра избыточного роста (PROS).

Методы. Материалом для исследования послужила ДНК из лейкоцитов периферической крови и биоптатов тканей. Для определения аналитических свойств метода моделировали уровень представленности альтернативного аллеля путём добавления в реакционную смесь образцов ДНК, гомозиготных по полиморфному и референсному вариантам, в разном соотношении.

Результаты. Минимально достоверно детектируемый уровень представленности альтернативного аллеля составил 1,5%. С использованием метода, основанного на применении ДСН, были подтверждены ранее выявленные на NGS-панели с глубоким покрытием генетические варианты PIK3CA у 9 пациентов с клиническими проявлениями PROS.

1. Keppler-Noreuil K.M., Sapp J.C., Lindhurst M.J., et al. Clinical delineation and natural history of the PIK3CA -related overgrowth spectrum. Am J Med Genet A. 2014;164(7):1713–1733. doi: 10.1002/ajmg.a.36552.

2. Keppler-Noreuil K.M., Rios J.J., Parker V.E.R., et al. PIK3CA -related overgrowth spectrum (PROS): Diagnostic and testing eligibility criteria, differential diagnosis, and evaluation. Am J Med Genet A. 2016;167(2):287–295. doi: 10.1002/ajmg.a.36836.

3. Nathan N., Keppler-Noreuil K.M., Biesecker L.G., et al. Mosaic Disorders of the PI3K/PTEN/AKT/TSC/mTORC1 Signaling Pathway. Dermatol Clin. 2017;35(1):51-60. doi: 10.1016/j.det.2016.07.001.

4. Parker V.E.R., Keppler-Noreuil K.M., Faivre L., et al. Safety and efficacy of low-dose sirolimus in the PIK3CA-related overgrowth spectrum. Genet Med. 2019;21(5):1189-1198. doi: 10.1038/s41436-018-0297-9.

5. Shagin D.A., Rebrikov D.V., Kozhemyako V.B., et al. A novel method for SNP detection using a new duplex-specific nuclease from crab hepatopancreas. Genome Res. 2002;12(12):1935-42. doi: 10.1101/gr.547002.

6. Shagin D.A., Rebrikov D.V. Molecular biology applications of the red king crab duplex-specific nuclease. Bulletin of RSMU. 2022;(1):5–10. doi: 10.24075/brsmu.2022.010.

7. Song C., Liu Y., Fontana R., et al. Elimination of unaltered DNA in mixed clinical samples via nuclease-assisted minor-allele enrichment. Nucleic Acids Res. 2016;44(19):e146. doi: 10.1093/nar/gkw650.

8. Ladas I., Fitarelli-Kiehl M., Song C., et al. Multiplexed Elimination of Wild-Type DNA and High-Resolution Melting Prior to Targeted Resequencing of Liquid Biopsies. Clinical Chemistry. 2017;63(10):1605–1613. doi:10.1373/clinchem.2017.272849.

9. Green M.R., Sambrook J. Isolation of High-Molecular-Weight DNA Using Organic Solvents. Cold Spring Harb Protoc. 2017;2017(4):pdb. prot093450. doi: 10.1101/pdb.prot093450.

10. Tanaka Y., Kanai F., Tada M., et al. Absence of PIK3CA hotspot mutations in hepatocellular carcinoma in Japanese patients. Oncogene. 2006;25(20):2950-2. doi: 10.1038/sj.onc.1209311.

11. Рыжкова О.П., Кардымон О.Л., Прохорчук Е.Б., и др. Руководство по интерпретации данных последовательности ДНК человека, полученных методами массового параллельного секвенирования (MPS) (редакция 2018, версия 2). Медицинская генетика. 2019;18(2):3-23. doi:10.25557/2073-7998.2019.02.3-23.

12. Davidson C.J., Zeringer E., Champion K.J., et al. Improving the limit of detection for Sanger sequencing: a comparison of methodologies for KRAS variant detection. Biotechniques. 2012;53(3):182-8. doi: 10.2144/000113913.

13. Сагоян Г.Б., Клецкая И.С., Имянитов Е.Н., и др. Спектр синдромов избыточного роста, связанных с мутацией PIK3CA. Обзор литературы. Российский журнал детской гематологии и онкологии (РЖДГиО). 2022;9(1):29-44. doi:10.21682/2311-1267-2022-9-1-29-44.

14. Singh S., Bradford D., Li X., et al. FDA Approval Summary: Alpelisib for PIK3CA-Related Overgrowth Spectrum. Clin Cancer Res. 2024;30(1):23–28. doi:10.1158/1078-0432.CCR-23-1270.

15. Angulo-Urarte A., Graupera M. When, where and which PIK3CA mutations are pathogenic in congenital disorders. Nat Cardiovasc Res. 2022;1(8):700–714. doi:10.1038/s44161-022-00107-8.