Особенности валидации герминальных вариантов в гене PMS2 у пациентов с наследственными опухолевыми синдромами

Введение.  Метод секвенирования по Сэнгеру в последние годы активно используется для валидации выявленных методом высокопроизводительного параллельного секвенирования (NGS) вариантов. Использование метода Сэнгера необходимо, когда выявленный вариант локализуется в гене, имеющем некоторое количество псевдогенов. Наличие псевдогенов осложняет поиск патогенных вариантов в белок-кодирующих участках. Ген PMS2, ассоциированный с синдромом Линча, имеет большое число псевдогенов  PMS2P1-PMS2P14 и  PMS2CL, поэтому для верификации выявленных патогенных вариантов требуются дополнительные методические подходы.

Цель:  отработать протокол валидации выявленных патогенных вариантов в гене PMS2 с учетом большого количества псевдогенов, имеющих высокий процент гомологии с участками, на которых расположены валидируемые варианты.

Методы. В статье представлены два случая с выявленными патогенными герминальными вариантами гена PMS2: chr7:5982823C>T (rs267608172) и chr7:6003716del (hg38).

Результаты. Для валидации варианта chr7:5982823C>T (экзон 12 гена  PMS2), выявленного методом полногеномного секвенирования, разработана схема с использованием ПЦР с вложенными праймерами. В первом раунде проведена амплификация длинного фрагмента, содержащего 9-12 экзоны, во втором раунде – амплификация целевого фрагмента, пригодного для секвенирования методом Сэнгера. Для валидации варианта chr7:6003716del (экзон 4 гена  PMS2) праймеры подобраны так, чтобы различия нуклеотидной последовательности гена и псевдогена располагались на 3’-конце прямого праймера. В результате для дальнейшего секвенирования методом Сэнгера используется целевой фрагмент без примеси псевдогена.  Таким образом, чтобы избежать ошибок при анализе  PMS2  методом секвенирования по Сэнгеру необходимо использовать специфические методические подходы, чтобы высокогомологичные последовательности псевдогенов не мешали прочтению последовательности функционального гена.

1. Vanin E.F. Processed pseudogenes: characteristics and evolution. Annu Rev Genet. 1985;19:253-72. doi: 10.1146/annurev.ge.19.120185.001345.

2. Claes K.B.M., Rosseel T., De Leeneer K. Dealing with Pseudogenes in Molecular Diagnostics in the Next Generation Sequencing Era. Methods Mol Biol. 2021;2324:363-381. doi: 10.1007/978-1-0716-1503-4_22.

3. van der Klift H.M., Tops C.M., Bik E.C., et al. Quantification of sequence exchange events between PMS2 and PMS2CL provides a basis for improved mutation scanning of Lynch syndrome patients. Hum Mutat. 2010 May;31(5):578-87. doi: 10.1002/humu.21229.

4. Clendenning M., Hampel H., LaJeunesse J., et al. Long-range PCR facilitates the identification of PMS2-specific mutations. Hum Mutat. 2006 May;27(5):490-5. doi: 10.1002/humu.20318. Erratum in: Hum Mutat. 2006;27(11):1155.

5. Vaughn C.P., Robles J., Swensen J.J., et al. Clinical analysis of PMS2: mutation detection and avoidance of pseudogenes. Hum Mutat. 2010;31(5):588-93. doi: 10.1002/humu.21230.

6. Рыжкова О.П., Кардымон О.Л., Прохорчук Е.Б., и др. Руководство по интерпретации данных последовательности ДНК человека, полученных методами массового параллельного секвенирования (MPS) (редакция 2018, версия 2). Медицинская генетика. 2019;18(2):3-23. https://doi.org/10.25557/2073-7998.2019.02.3-23

7. Hereditary Cancer Syndromes and Risk Assessment: ACOG COMMITTEE OPINION, Number 793. Obstet Gynecol. 2019;134(6):e143-e149. doi: 10.1097/AOG.0000000000003562.

8. Nicolaides N.C., Papadopoulos N., Liu B., et al. Mutations of two PMS homologues in hereditary nonpolyposis colon cancer. Nature. 1994;371(6492):75-80. doi: 10.1038/371075a0.

9. Senter L., Clendenning M., Sotamaa K., et al. The clinical phenotype of Lynch syndrome due to germline PMS2 mutations. Gastroenterology. 2008;135(2):419-28. doi: 10.1053/j.gastro.2008.04.026.

10. Ten Broeke S.W., van der Klift H.M., Tops C.M.J., et al. Cancer Risks for PMS2-Associated Lynch Syndrome. J Clin Oncol. 2018;36(29):2961-2968. doi: 10.1200/JCO.2018.78.4777. Erratum in: J Clin Oncol. 2019 Mar 20;37(9):761.

11. Cannavo E., Marra G., Sabates-Bellver J., et al. Expression of the MutL homologue hMLH3 in human cells and its role in DNA mismatch repair. Cancer Res. 2005;65(23):10759-66. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-05-2528.

12. Korhonen M.K., Raevaara T.E., Lohi H., Nyström M. Conditional nuclear localization of hMLH3 suggests a minor activity in mismatch repair and supports its role as a low-risk gene in HNPCC. Oncol Rep. 2007;17(2):351-4.

13. ten Broeke S.W., Brohet R.M., Tops C.M., et al. Lynch syndrome caused by germline PMS2 mutations: delineating the cancer risk. J Clin Oncol. 2015;33(4):319-25. doi: 10.1200/JCO.2014.57.8088.

14. Шелыгин Ю.А., Ачкасов С.И., Семёнов Д.А., и др. Генетические и фенотипические характеристики 60 российских семей с синдромом Линча. Колопроктология. 2021;20(3):35–42. http://dx.doi.org/10.33878/2073-7556-2021-20-3-35-42

15. Kasela M., Nyström M., Kansikas M. PMS2 expression decrease causes severe problems in mismatch repair. Hum Mutat. 2019;40(7):904-907. doi: 10.1002/humu.23756.

16. Hendriks Y.M., Jagmohan-Changur S., van der Klift H.M., et al. Heterozygous mutations in PMS2 cause hereditary nonpolyposis colorectal carcinoma (Lynch syndrome). Gastroenterology. 2006;130(2):312-22. doi: 10.1053/j.gastro.2005.10.052.

17. Clendenning M., Hampel H., LaJeunesse J., et al. Long-range PCR facilitates the identification of PMS2-specific mutations. Hum Mutat. 2006;27(5):490-5. doi: 10.1002/humu.20318. Erratum in: Hum Mutat. 2006;27(11):1155.

18. Vaughn C.P., Robles J., Swensen J.J., et al. Clinical analysis of PMS2: mutation detection and avoidance of pseudogenes. Hum Mutat. 2010;31(5):588-93. doi: 10.1002/humu.21230.

19. Li J., Dai H., Feng Y., et al. A Comprehensive Strategy for Accurate Mutation Detection of the Highly Homologous PMS2. J Mol Diagn. 2015;17(5):545-53. doi: 10.1016/j.jmoldx.2015.04.001.

20. Nicolaides N.C., Kinzler K.W., Vogelstein B. Analysis of the 5’ region of PMS2 reveals heterogeneous transcripts and a novel overlapping gene. Genomics. 1995;29(2):329-34. doi: 10.1006/geno.1995.9997.

21. Hayward B.E., De Vos M., Valleley E.M., et al. Extensive gene conversion at the PMS2 DNA mismatch repair locus. Hum Mutat. 2007;28(5):424-30. doi: 10.1002/humu.20457. PMID: 17253626.

22. Auclair J., Leroux D., Desseigne F., et al. Novel biallelic mutations in MSH6 and PMS2 genes: gene conversion as a likely cause of PMS2 gene inactivation. Hum Mutat. 2007;28(11):1084-90. doi: 10.1002/humu.20569.

23. Ganster C., Wernstedt A., Kehrer-Sawatzki H., et al. Functional PMS2 hybrid alleles containing a pseudogene-specific missense variant trace back to a single ancient intrachromosomal recombination event. Hum Mutat. 2010;31(5):552-60. doi: 10.1002/humu.21223.

24. Семенова А. Б., Бяхова М. М., Галкин В. Н., и др. Возможности молекулярно-генетических методов для эффективного выявления наследственных форм онкологических заболеваний среди лиц с повышенными рисками их развития. Здоровье мегаполиса. 2023; 4(2):30-40. doi:10.47619/2713-2617.zm.2023.v.4i2;30-40.