Методика пренатальной молекулярно-генетической диагностикиврожденной гиперплазии коры надпочечников, обусловленной дефицитом 21-гидроксилазы

Цель: представление метода пренатальной молекулярно-генетической диагностики (ПД) врожденной гиперплазии коры надпочечников (ВГКН) с использованием анализа частых патогенных вариантов, косвенной диагностики и анализа пола. Методы. Молекулярно-генетические исследования выполнены на образцах ДНК, выделенных из образцов цельной крови и ворсин хориона. Стратегия исследования основана на методах из литературных источников, собственных модификациях и разработках. Исследование включало анализ частых патогенных вариантов гена CYP21A2 (P30L, IVS2AS A/C-G, -13, 8 bp del, I172N, V281L, Q318X, R356W, P453S), перестройки между геном и псевдогеном (делеция 30 т.п.н.), косвенных STR-маркеров (TNFa, D6S273, D6S2781, LH1, D6S1666, D6S2443) и пола плода (SRY и AMELX/AMELY). Базовым методом для всех этапов служила полимеразная цепная реакция (ПЦР). При анализе точковых мутаций гена CYP21A2 использовали подход двухраундовой ПЦР и последующего рестрикционного анализа. Для детекции применяли методы гель-электрофореза и фрагментного анализа на генетическом анализаторе. Результаты. В нашем исследовании детально описано пренатальное молекулярно-генетическое исследование ВГКН с особенностями всех этапов тестирования. В семье, планирующей ПД и имеющей ребенка с сольтеряющей формой ВГКН, проводилось предварительное молекулярно-генетическое обследование. У больного ребенка выявлен компаундный генотип с патогенными вариантами IVS2AS A/C-G, -13 материнского происхождения и комплексным мутантным аллелем P30L + 8 bp del + IVS2AS A/C-G, -13 отцовского происхождения. В образце плода нами выявлен гетерозиготный генотип с патогенным материнским вариантом во втором интроне. Исследованные полиморфные STR-локусы, фланкирующие ген CYP21A2, подтвердили нормальный отцовский и патогенный материнский гаплотипы у плода. Дополнительно данные по STR свидетельствовали об отсутствии контаминации материала плода материнской ДНК. У матери неинформативными (гомозиготными) были два микросателлитных маркера, у отца информативны были все шесть. Заключение. Предложенная нами система молекулярно-генетического тестирования, включающая анализ патогенных вариантов в сочетании с косвенной диагностикой по STR-маркерам и анализом пола позволяет обеспечить надежный вариант ПД ВГКН.

врожденная гиперплазия коры надпочечников, ВГКН, АГС, пренатальная диагностика, ген CYP21A2, STR

1. OMIM #201910: Adrenal Hyperplasia, Congenital, due to 21-Hydroxylase Deficiency. https://omim.org/entry/201910.

2. Nimkarn S, Gangishetti PK, Yau M, et al. 21-Hydroxylase-Deficient Congenital Adrenal Hyperplasia. 2002 Feb 26 [Updated 2016 Feb 4]. In: Adam MP, Mirzaa GM, Pagon RA, et al., editors. GeneReviews® [Internet]. Seattle (WA): University of Washington, Seattle; 1993-2022. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1171/.

3. Merke D.P., Auchus R.J. Congenital Adrenal Hyperplasia Due to 21-Hydroxylase Deficiency. N Engl J Med. 2020;383(13):1248-1261. doi:10.1056/NEJMra1909786.

4. Speiser P.W., White P.C. Congenital Adrenal Hyperplasia. N Engl J Med. 2003;349(8):776-788. doi:10.1056/NEJMra021561.

5. Мокрышева НГ, Мельниченко ГА, Адамян ЛВ и др. Клинические рекомендации «Врожденная дисфункция коры надпочечников (адреногенитальный синдром)». Ожирение и метаболизм. 2021;18(3):345-382. https://doi.org/10.14341/omet12787.

6. Карева МА. Врожденная дисфункция коры надпочечников у детей: эпидемиология, генетическая основа, персонализированный подход к диагностике и лечению, мониторинг соматического и репродуктивного здоровья. Автореферат дисс. на соискание ученой степени д.м.н. М., 2018. 46 с. https://www.dissercat.com/content/vrozhdennaya-disfunktsiya-kory-nadpochechnikov-u-detei-epidemiologiya-geneticheskaya-osnova.

7. Yau M., Khattab A., New M.I. Prenatal Diagnosis of Congenital Adrenal Hyperplasia. Endocrinol Metab Clin North Am. 2016;45(2):267-81. doi:10.1016/j.ecl.2016.01.001.

8. Narasimhan M.L., Khattab A. Genetics of congenital adrenal hyperplasia and genotype-phenotype correlation. Fertility and Sterility. 2019;111(1):24-29. https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2018.11.007.

9. New M.I., Abraham M., Gonzalez B. et al. Genotype-phenotype correlation in 1,507 families with congenital adrenal hyperplasia owing to 21-hydroxylase deficiency. PNAS. 2013;12,110(7): 2611-2616. www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1300057110.

10. Осиновская Н.С., Султанов И.Ю. Идентификации двух мутаций в транс-положении в гене CYP21A2 у плода без врожденной дисфункции коры надпочечников (ВДКН). Случай пренатальной диагностики. Медицинская генетика 2017;16(5):39-41.

11. Oh B.H., Park J.K., Choi Y.M. et al. Prenatal Diagnosis of Heterozygote of Salt Wasting Congenital Adrenal Hyperplasia due to 21-Hydroxylase Deficiency by Genetic Linkage Analysis. Journal of Korean Medical Science. 1988; 3(2):73-77.

12. Mao R., Nelson L., Kates R. et al. Prenatal diagnosis of 21-hydroxylase deficiency caused by gene conversion and rearrangements: pitfalls and molecular diagnostic solutions. Prenatal Diagnosis. 2002; 22(13): 1171-1176. doi: 10.1002/pd.467.

13. Kazmi D., Bailey J., Yau M. et al. New Developments in Prenatal Diagnosis of Congenital Adrenal Hyperplasia. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 2017;165(Pt A):121-123. doi: 10.1016/j.jsbmb.2016.06.016.

14. Vermeulen С., Geeven G., de Wit E. et al. Sensitive Monogenic Noninvasive Prenatal Diagnosis by Targeted Haplotyping. The American Journal of Human Genetics. 2017;101(7):326-339. http://dx.doi.org/10.1016/j.ajhg.2017.07.012.

15. Oriola J., Plensa I., Machuca I. et al. Rapid screening method for detecting mutations in the 21-hydroxylase gene. Clinical Chemistry. 1997; 43(4): 557-561.

16. Keen-Kim D., Redman J.B., Alanes R.U. Validation and Clinical Application of a Locus-Specific Polymerase Chain Reaction- and Minisequencing-Based Assay for Congenital Adrenal Hyperplasia (21-Hydroxylase Deficiency). Journal of Molecular Diagnostics. 2005;7(2):236-246. doi: 10.1016/S1525-1578(10)60550-8.

17. Sullivan K.M., Mannucci A., Kimpton C.P., Gill P. A rapid and quantitative DNA sex test: fluorescence-based PCR analysis of X-Y homologous gene amelogenin. BioTechniques. 1993;15: 637-641.

18. OMIM *613815 Cytochrome P450, Family 21, Subfamily A, Polypeptide 2; CYP21A2. https://omim.org/entry/613815.

19. ClinVar. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/.

20. Reyes T.M.E., Mesa T.C., Cruz P.A.L. et al. Molecular diagnosis of patients with congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency. BME Endocrine Disoders. 2020;20:165 https://doi.org/10.1186/s12902-020-00643-z.