Разработка и характеристика метода многолокусной метилчувствительной ПЦР в режиме реального времени

Введение. Метод метилчувствительной количественной ПЦР (МЧ-кПЦР) в режиме реального времени впервые описан в настоящей работе в многолокусном формате с использованием TaqMan-зондов. Многолокусный формат реакции облегчает тестирование больших выборок пациентов и способствует бережному расходованию коллекционных образцов биологического материала, а также позволяет включать в состав тест-систем необходимые контроли, обеспечивающие оценку полноты гидролиза матрицы и эффективности ПЦР. Цель: разработать тест-систему многолокусной МЧ-кПЦР для количественного анализа уровня метилирования ДНК и охарактеризовать её аналитические свойства. Методы. Материалом исследования служили смеси ДНК с заданным уровнем метилирования (препаратов ДНК, гидролизованных и негидролизованных метилчувствительной рестриктазой). Считали, что ДНК, необработанная метилчувствительной рестриктазой BstHHI, является модельной метилированной матрицей, в то время как гидролизованная ДНК - модельной неметилированной матрицей. МЧ-кПЦР проводили для двух целевых локусов - участков CpG-островков генов PRKCB и GMDS с включением положительного внутреннего контроля эффективности ПЦР и контроля полноты гидролиза геномной ДНК метилчувствительной эндонуклеазой рестрикции. Для кинетических кривых исследуемых локусов с помощью пакета qpcR языка программирования R во всех образцах получены значения Cy0, и на основе этих данных рассчитали уровни метилирования модельных препаратов с заданными уровнями метилирования. Аналитическую чувствительность метода определяли путем нахождения значений Limit of Blank (LoB, измеряемое значение при отсутствии метилирования) и Limit of Detection (LoD, наименьший измеряемый уровень метилирования). Результаты. Определены аналитические свойства метода МЧ-кПЦР: аналитическая чувствительность составила 5%; относительная погрешность составила 11,38%; коэффициент детерминации (R2) для локусов PRKCB и GMDS составил 0,98 и 0,77, соответственно. Результаты измерений по локусу GMDS позволили предположить его моноаллельное метилирование в нормальных лимфоцитах крови, что было подтверждено анализом баз данных метилома человека. Исходя из полученных результатов, аналитическая чувствительность метода МЧ-кПЦР выше таковой метода прямого бисульфитного секвенирования по Сэнгеру и не уступает методу бисульфитного пиросеквенирования.

количественная ПЦР, метилирование ДНК, мультиплексная ПЦР, метилчувствительные эндонуклеазы рестрикции

1. Beikircher G., Pulverer W., Hofner M., et al. Multiplexed and sensitive DNA methylation testing using methylation-sensitive restriction enzymes “MSRE-qPCR”. Methods Mol Biol. 2018; 1708: 407-424. doi: 10.1007/978-1-4939-7481-8_21.

2. Radhakrishnan R., Kabekkodu S., Satyamoorthy K. DNA hypermethylation as an epigenetic mark for oral cancer diagnosis. Journal of Oral Pathology and Medicine 2011; 40(9): 665-676.

3. Kulis M., Esteller M. DNA Methylation and Cancer. Advances in Genetics 2010; 70: 27-56. doi: 10.1016/B978-0-12-380866-0.60002-2.

4. Yoo C.B., Jones P.A. Epigenetic therapy of cancer: past, present and future. Nat Rev Drug Discov. 2006; 5(1): 37-50.

5. Esteller M. Epigenetics in Cancer. NEJM 2008; 358(11): 1148-1159.

6. Tanaka K., Okamoto A. Degradation of DNA by bisulfite treatment. Bioorg Med Chem Lett. 2007 Apr 1; 17(7): 1912-5. doi: 10.1016/j.bmcl.2007.01.040.

7. Raizis A.M., Schmitt F., Jost J.P. A Bisulfite Method of 5-Methylcytosine Mapping That Minimizes Template Degradation. Anal Biochem. 1995; 226(1): 161-166.

8. Grunau C., Clark S.J., Rosenthal A. Bisulfite genomic sequencing: systematic investigation of critical experimental parameters. Nucleic Acids Res. 2001; 29(13): E65-5. doi: 10.1093/nar/29.13.e65.

9. Amenya H.Z., Tohyama C., Ohsako S. Dioxin induces Ahr-dependent robust DNA demethylation of the Cyp1a1 promoter via Tdg in the mouse liver. Sci Rep. 2016; 6: 34989. doi: 10.1038/srep34989.

10. Krygier M., Podolak-Popinigis, Limon J., et al. A simple modification to improve the accuracy of methylation-sensitive restriction enzyme quantitative polymerase chain reaction. Anal Biochem. 2016; 500: 88-90. doi: 10.1016/j.ab.2016.01.020.

11. Umer M., Herceg Z. Deciphering the epigenetic code: An overview of DNA methylation analysis methods. Antioxid Redox Signal. 2013; 18(15): 1972-86. doi: 10.1089/ars.2012.4923.

12. Pajares M.J., Palanca-Ballester C., Urtasun R., et al. Methods for analysis of specific DNA methylation status. Methods 2021; 187: 3-12. doi: 10.1016/j.ymeth.2020.06.021.

13. Dahl C., Guldberg P. DNA methylation analysis techniques. Biogerontology 2003; 4(4): 233-50. doi: 10.1023/a:1025103319328.

14. Lekanne Deprez R.H., Fijnvandraat A.C., Ruijter J.M., et al. Sensitivity and accuracy of quantitative real-time polymerase chain reaction using SYBR green I depends on cDNA synthesis conditions. Anal Biochem. 2002; 307(1): 63-69.

15. Huggett J.F., Cowen S., Foy C.A. Considerations for digital PCR as an accurate molecular diagnostic tool. Clin Chem. 2015; 61(1): 79-88.

16. Thomassin H., Kress C., Grange T. MethylQuant: a sensitive method for quantifying methylation of specific cytosines within the genome. Nucleic Acids Res. 2004; 32(21): e168. doi: 10.1093/nar/gnh166.

17. Köchl S., Niederstätter H., Parson W. DNA extraction and quantitation of forensic samples using the phenol-chloroform method and real-time PCR. Methods Mol Biol. 2005; 297: 13-30.

18. Tolstrup N., Nielsen P.S., Kolberg J.G., et al. OligoDesign: optimal design of LNA (locked nucleic acid) oligonucleotide capture probes for gene expression profiling. Nucleic Acids Res. 2003; 31(13): 3758-62. doi: 10.1093/nar/gkg580.

19. Mouritzen P., Nielsen A.T., Pfundheller H.M., et al. Single nucleotide polymorphism genotyping using locked nucleic acid (LNATM). Expert Rev Mol Diagn. 2003; 3(1): 27-38.

20. Guescini M., Sisti D., Rocchi M.B.L., et al. Accurate and Precise DNA Quantification in the Presence of Different Amplification Efficiencies Using an Improved Cy0 Method. PLoS One 2013; 8(7): e68481. doi: 10.1371/journal.pone.0068481.

21. Armbruster D.A., Pry T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. Clin Biochem Rev. 2008; 29 Suppl 1(Suppl 1): S49-52.

22. Ucar I., Pebesma E., Azcorra A. Measurement Errors in R. The R Journal. 2019; 10(2): 549-557.

23. Lebrón R., Gómez-Martín С., Carpena P., et al. NGSmethDB 2017: enhanced methylomes and differential methylation. Nucleic Acids Res. 2017; 45(D1): D97-D103.

24. Lewin J., Schmitt A.O., Adorján P., et al. Quantitative DNA methylation analysis based on four-dye trace data from direct sequencing of PCR amplificates. Bioinformatics 2004; 20(17): 3005-12. doi: 10.1093/bioinformatics/bth346.

25. Kurdyukov S, Bullock M. DNA methylation analysis: Choosing the right method. Biology (Basel) 2016; 5(1): 3. doi: 10.3390/biology5010003.