Устранение экспериментальных отклонений при количественном анализе профилей метилирования ДНК посредством высокопроизводительного бисульфитного секвенирования и гибридизации на олигонуклеотидных ДНК-чипах

Количественный анализ профилей метилирования ДНК является неотъемлемым аспектом исследований в области эпигенетических механизмов онкогенеза. Кроме того, детекция опухолеспецифичных эпигенетических аномалий обладает высоким диагностическим потенциалом. При анализе генов-кандидатов, как правило, используют ПЦР-амплификацию модифицированных бисульфитом генных областей. Поскольку измерение степени метилирования CpG-динуклеотидов происходит в ампликонах, ПЦР определяет точность всего анализа. Избирательная амплификация форм ДНК, различающихся характером метилирования, может затруднять интерпретацию результатов. Дополнительные экспериментальные искажения могут быть связаны с особенностями технологий детекции метилированных оснований, например специфичностью олигонуклеотидных зондов ДНК-чипов. Целью работы было исследование применимости предложенного нами ранее алгоритма для устранения экспериментальных искажений из количественных данных метилирования ДНК, которые получены методами высокопроизводительного бисульфитного секвенирования и гибридизации на олигонуклеотидных ДНК-чипах. Материалы и методы. Для количественной характеристики профилей метилирования ДНК вблизи точек начала транскрипции генов-кандидатов использованы методы высокопроизводительного бисульфитного секвенирования по технологии 454 и гибридизации на ДНК-чипах «Febit Biotech». Регрессионный анализ полученных величин метилирования ДНК проводили посредством кубических полиномиальных кривых. Результаты. Для анализа были выбраны гены, аномальное гиперметилирование которых обнаруживается в злокачественных новообразованиях: кодирующие субъединицы фермента сукцинатдегидрогеназы SDH , а также онкосупрессоры CDKN2B , DAPK1 и TP53 . Анализируемые регионы амплифицировали в контрольных пробах ДНК известной степени метилирования. Амплификация и последующее секвенирование ампликонов SDHB и SDHD выявили значительные отклонения от ожидаемых величин метилирования. Аналогично индексы метилирования рассмотренных CpG-динуклеотидов в генах CDKN2B и DAPK1 существенно искажались при гибридизации на ДНК-чипе. С помощью уравнений полученных кубических регрессионных кривых была проведена корректировка исходных данных с практически полным устранением артефактов. Выводы. Применение кубической полиномиальной регрессии для корректировки экспериментальных искажений в двух разных типах количественных данных метилирования ДНК - полученных высокопроизводительным бисульфитным секвенированием и гибридизацией на олигонуклеотидных ДНК-чипах - продемонстрировало практически полное устранение артефактов, и, следовательно, универсальность метода.

метилирование ДНК, количественный анализ, ПЦР-отклонение, кубическая регрессия, высокопроизводительное бисульфитное секвенирование, олигонуклеотидные ДНК-чипы, DNA methylation, quantitative analysis, PCR-bias, cubic polynomial regression, next-generation sequencing, oligonucleotide microarrays

1. Пономарева А.А., Рыкова Е.Ю., Чердынцева Н.В. и др. Анализ уровень метилирования гена RARb2 в циркулирующих ДНК крови у больных раком легкого как потенциального прогностического маркера. Вопросы онкологии. 2011;57(3):302-307.

2. Брызгунова О.Е., Лактионов П.П. Формирование пула циркулирующих ДНК крови: источники, особенности строения и циркуляции. Биомедицинская химия. 2015;61(4):409-426.

3. Miettinen M., Lasota J. Gastrointestinal stromal tumors: pathology and prognosis at different sites. Semin Diagn Pathol. 2006;23(2).70-83.

4. Haller F., Zhang J.D., Moskalev E.A. et al. Combined DNA methylation and gene expression profiling in gastrointestinal stromal tumors (GISTs) reveals hypomethylation of SPP1 as an independent prognostic factor. International Journal of Cancer. 2015;136(5):1013-1023.

5. Gausachs M., Pilar M., Corral J. et al. MLH1 promoter hypermethylation in the analytical algorithm of Lynch syndrome& a costsseffectiveness study. Eur J Hum Genet. 2012; 20(7):762-768.

6. Bettstetter M., Dechant S., Ruemmele P. et al. Distinction of hereditary nonpolyposis colorectal cancer and sporadic microsatellite-unstable colorectal cancer through quantification of MLH1 methylation by real-time PCR. Clin Cancer Res. 2007;13:3221-3228.

7. Haller F., Moskalev E.A., Faucz F.R. et al. Aberrant DNA hypermethylation of SDHC: a novel mechanism of tumor development in Carney Triad. Endocrine Related Cancer. 2014;21(4):567-577.

8. Frommer M., McDonald L.E., Millar D.S. et al. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc Natl Acad Sci USA. 1992;89(5):1827-1831.

9. Warnecke P.M., Stirzaker C., Melki J.R. et al. Detection and measurement of PCR bias in quantitative methylation analysis of bisulphite-treated DNA. Nucleic Acids Research. 1997;25(21):4422-4426.

10. Moskalev E.A., Zavgorodnij M.G., Majorova S.P. et al. Correction of PCR-bias in quantitative DNA methylation studies by means of cubic polynomial regression. Nucleic Acids Research. 2011;39(11):e77.

11. Shen L., Guo Y., Chen X. et al. Optimizing annealing temperature overcomes bias in bisulfite PCR methylation analysis. BioTechniques. 2007;42(1):48-58.

12. Wojdacz T.K., Hansen L.L., Dobrovic A. A new approach to primer design for the control of PCR bias in methylation studies. BMC Res. Notes. 2008;1:54.

13. Москалев Е.А. Аномальные картины метилирования геномной ДНК при хроническом B-клеточном лимфолейкозе.: дис. канд. биол. наук. Воронежский государственный университет, Воронеж, 2007.

14. Rohde C., Zhang Y., Reinhardt R. et al. BISMA - fast and accurate bisulfite sequencing data analysis of individual clones from unique and repetitive sequences. BMC Bioinformatics. 2010;11:230.

15. Guimil R., Beier M., Scheffler M. et al. Geniom technology - the benchtop array facility. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2003;22(5-8):1721-1723.

16. Mund C., Beier V., Bewerunge P. et al. Array-based analysis of genomic DNA methylation patterns of the tumour suppressor gene p16INK4A promoter in colon carcinoma cell lines. Nucleic Acids Res. 2005;33(8):e73.