Исключение неверно картированных прочтений при таргетном высокопроизводительном секвенировании ДНК с использованием технологии Ion AmpliSeq

Актуальность. Использование высокопроизводительного параллельного секвенирования (ВПС) сопряжено с ошибками: не все генетические варианты, выявляемые с использованием ВПС, являются истинными и подтверждаются альтернативными методами. Частичный вклад в выявление ложноположительных вариантов вносят недостоверно картированные прочтения. Мы полагаем, что при проведении таргетного секвенирования с использованием технологии Ion AmpliSeq (таргетное обогащение мультиплексной ПЦР) задача исключения недостоверно картированных прочтений может быть решена алгоритмически с использованием информации о геномных координатах таргетных регионов и длине праймеров, использованных при амплификации фрагментов библиотек. Эта информация позволяет оценить правильность картирования каждого прочтения и исключить из дальнейшего анализа прочтения, не соответствующие дизайну эксперимента. Цель. Разработать алгоритм минимизации вклада ошибок картирования в спектр генетических вариантов, выявляемых при ВПС. Материалы и методы. С использованием информации о геномных координатах таргетных регионов и праймерах проанализировано 30 файлов формата BAM, полученных по результатам ВПС с использованием технологии таргетного секвенирования Ion AmpliSeq и коммерческих панелей праймеров Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel (15,992 таргетных региона) и Ion AmpliSeq Inherited Disease Panel (10,309 таргетных регионов). Алгоритм исключения неверно картированных прочтений реализовали средствами языка программирования Python. Результаты. Проведено сравнение исходного набора прочтений и набора, полученного после исключения неверно картированных прочтений. Определены три группы генетических вариантов: (1) выявляемые в обоих наборах прочтений - 6072 варианта; (2) выявляемые исключительно в исходном наборе - 127 (варианты, наблюдаемые в большинстве образцов, могут быть интерпретированы как результат систематических ошибок выравнивания); (3) выявляемые только в наборе прочтений, полученном удалением неверно картированных, - 63 истинных, ранее скрытых варианта. Выводы. Использование дополнительной информации об ожидаемом начале и окончании прочтения при таргетном исследовании позволяет (1) уменьшить количество выявляемых вариантов, обусловленных ошибочно картированными прочтениями, (2) детектировать ранее не обнаруживаемые по причине ложной малой аллельной частоты, (3) получить более достоверные значения аллельных частот выявляемых вариантов. Применение разработанного нами алгоритма исключения неверного картирования прочтений фрагментов ДНК повышает качество интерпретации результатов ВПС, что особенно важно при проведении ДНК-диагностики.

NGS, таргетное секвенирование, Ion AmpliSeq, ошибки картирования, NGS, target sequencing, Ion AmpliSeq, mapping errors

1. Г.В. Байдакова, Е.Ю. Захарова, И.В. Канивец, Ф.А. Коновалов, В.В. Стрельников, С.И. Куцев. Диагностика врожденных и наследственных болезней у детей: достижения и перспективы развития. Вестник Росздравнадзора. 2016; 3: 27-33.

2. Ребриков Д.В., Коростин Д.О., Шубина Е.С., Ильинский В.В. NGS: высокопроизводительное секвенирование, 2-е издание. М.: БИНОМ. 2015; С. 209.

3. Worthey E.A. Analysis and Annotation of Whole-Genome or Whole-Exome Sequencing-Derived Variants for Clinical Diagnosis. Human Genetics. 2013; 24: 1-24.

4. Yang Y., Muzny D.M., Reid J.G. Clinical Whole-Exome Sequencing for the Diagnosis of Mendelian Disorders. The New England Journal of Medicine. 2013; 69: 501-512.

5. Sikkema-Raddatz B., Johansson L.F, de Boer E.N., Almomani R., Boven L.G. Targeted Next-Generation Sequencing can replace Sanger Sequencing in clinical diagnostics. Human Mutation. 2013; 10: 83-92.

6. Mi-Hyun Park, Hwanseok Rhee, Jung Hoon Park, Soo Kyung Koo. Comprehensive Analysis to Improve the Validation Rate for Single Nucleotide Variants Detected by Next-Generation Sequencing. PLOS ONE. 2014; 9(1): e86664.