Создание собственных несерийных ДНК-зондов для выявления рекуррентной анеуплоидии по хромосоме 12 в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках человека методом FISH

Введение. Спонтанные хромосомные аберрации в линиях индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК) обнаруживаются с частотой около 20%, что препятствует их дальнейшему использованию в исследовательских и медицинских целях. Одним из наиболее рациональных подходов к рутинному контролю генетической стабильности иПСК является таргетное выявление рекуррентных аномалий кариотипа, 20-60% которых может составлять трисомия по хромосоме 12. Трисомия 12 приводит к нарушению способности к дифференцировке, динамики репликации и сопровождается быстрым вытеснением эуплоидного клона.

Цель. Разработка протокола получения флуоресцентных ДНК-зондов, специфичных к перицентромерным повторам хромосомы 12, для выявления анеуплоидии методом FISH.

Результаты. Разработан двухстадийный протокол получения ДНК-зондов на основе ПЦР с геномной ДНК в качестве матрицы с последующим клик-химическим прямым мечением флуорохромом. На линиях иПСК с известными эуплоидным и анеуплоидным кариотипами отработаны условия гибридизации и подтверждена эффективность и специфичность выявления хромосомы 12 на метафазных пластинках и в интерфазных ядрах.

Выводы. FISH с собственными несерийными ДНК-зондами повышает доступность исследования копийности хромосомы 12 в иПСК, что способствует своевременному выявлению функционально значимых генетических нарушений в клеточных линиях.

1. Deng C., Ya A., Compton D.A., Godek K.M. A pluripotent developmental state confers a low fidelity of chromosome segregation. Stem Cell Reports. 2023;18(2):475-488. doi:10.1016/j.stemcr.2022.12.008.

2. Milagre I., Pereira C., Oliveira R.A. Compromised Mitotic Fidelity in Human Pluripotent Stem Cells. Int J Mol Sci. 2023 Jul 25;24(15):11933. doi:10.3390/ijms241511933.

3. Al Delbany D., Ghosh M.S., Krivec N., et al. De Novo Cancer Mutations Frequently Associate with Recurrent Chromosomal Abnormalities during Long-Term Human Pluripotent Stem Cell Culture. Cells. 2024;13(16):1395. doi:10.3390/cells13161395.

4. Stavish D., Price C.J., Gelezauskaite G., et al. Feeder-free culture of human pluripotent stem cells drives MDM4-mediated gain of chromosome 1q. Stem Cell Reports. 2024;19(8):1217-1232. doi:10.1016/j.stemcr.2024.06.003.

5. DuBose C.O., Daum J.R., Sansam C.L., Gorbsky GJ. Dynamic Features of Chromosomal Instability during Culture of Induced Pluripotent Stem Cells. Genes (Basel). 2022;13(7):1157. doi:10.3390/genes13071157.

6. Baker D., Hirst A.J., Gokhale P..J, et al. Detecting Genetic Mosaicism in Cultures of Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 2016;7(5):998-1012. doi:10.1016/j.stemcr.2016.10.003.

7. Ludwig T.E., Andrews P.W., Barbaric I., et al. ISSCR standards for the use of human stem cells in basic research. Stem Cell Reports. 2023;18(9):1744-1752. doi:10.1016/j.stemcr.2023.08.003.

8. McIntire E., Taapken S., Leonhard K., Larson A.L. Genomic Stability Testing of Pluripotent Stem Cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 2020 Mar;52(1):e107. doi:10.1002/cpsc.107.

9. Ben-David U., Arad G., Weissbein U. et al. Aneuploidy induces profound changes in gene expression, proliferation and tumorigenicity of human pluripotent stem cells. Nat Commun. 2014; 5, 4825. Doi:10.1038/ncomms5825.

10. Khademi N.S., Farivar S., Bazrgar M., et al. Aneuploidy Rate and Stemness in Low-Level Mosaic Human Embryonic Stem Cells in the Presence/Absence of Bortezomib, Paclitaxel, and Lapatinib. Cells Tissues Organs. 2024;213(1):17-23. doi:10.1159/000526199.

11. Lamm N., Ben-David U., Golan-Lev T., et al. Genomic Instability in Human Pluripotent Stem Cells Arises from Replicative Stress and Chromosome Condensation Defects. Cell Stem Cell. 2016;18(2):253-61. doi:10.1016/j.stem.2015.11.003.

12. Yanagihara K., Hayashi Y., Liu Y., et al. Trisomy 12 compromises the mesendodermal differentiation propensity of human pluripotent stem cells. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2024;60(5):521-534. doi:10.1007/s11626-023-00824-9.

13. Contreras-Galindo R., Fischer S., Saha A.K. et al. Rapid molecular assays to study human centromere genomics. Genome Res. 2017;27(12):2040-2049. doi:10.1101/gr.219709.116.

14. Sharma R., Meister P. Generation of Inexpensive, Highly Labeled Probes for Fluorescence In Situ Hybridization (FISH). STAR Protoc. 2020;1(1):100006. doi:10.1016/j.xpro.2019.100006.

15. Lengauer C., Dunham I., Featherstone T., Cremer T. Generation of alphoid DNA probes for fluorescence in situ hybridization (FISH) using the polymerase chain reaction. Methods Mol Biol. 1994; 33: 51-61. doi: 10.1385/0-89603-280-9:51. PMID: 7894592.

16. Zhigalina D.I., Skryabin N.A., Vasilieva O.Y. et al. FISH Diagnostics of Chromosomal Translocation with the Technology of Synthesis of Locus-Specific DNA Probes Based on Long-Range PCR. Russ J Genet. 2020; 5 6:739–746. https://doi.org/10.1134/S1022795420060150

17. Durm M., Haar F.M., Hausmann M., et al. Optimization of fast-fluorescence in situ hybridization with repetitive alpha-satellite probes. Z Naturforsch C J Biosci. 1996;51(3-4):253-61. doi: 10.1515/znc-1996-3-418.

18. Пожитнова В.О., Свиридова В.В., Кислова А.В., и др. Аномалии кариотипа в линиях индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных от российских доноров. Медицинская генетика. 2023;22(12):59-66. https://doi.org/10.25557/2073-7998.2023.12.59-66

19. Dekel-Naftali M., Aviram-Goldring A., Litmanovitch T., et al. Screening of human pluripotent stem cells using CGH and FISH reveals low-grade mosaic aneuploidy and a recurrent amplification of chromosome 1q. Eur J Hum Genet. 2012;20(12):1248-55. doi: 10.1038/ejhg.2012.128.

20. Peterson S.E., Westra J.W., Rehen S.K., et al. Normal human pluripotent stem cell lines exhibit pervasive mosaic aneuploidy. PLoS One. 2011;6(8):e23018. doi: 10.1371/journal.pone.0023018