Скрининг направляющих РНК для восстановления рамки считывания в гене DMD методом геномного редактирования

Мышечная дистрофия Дюшенна является самой распространённой мышечной дистрофией у детей. Причиной заболевания наиболее часто являются делеции экзонов 43-55 гена DMD, приводящие к сдвигу рамки считывания и отсутствию экспрессии
функционального белка дистрофина. Для восстановления рамки считывания наиболее оптимальным является подход пропуска
дополнительного экзона. Для того, чтобы удалить экзон полностью необходимо внести два двухцепочечных разрыва ДНК, что сопряжено с рядом негативных последствий. Однако перманентного пропуска экзона также можно добиться, разрушив сайт сплайсинга единственным разрывом ДНК с последующей репарацией путём негомологичного соединения концов. Для оценки
возможности реализации данной стратегии нами был проведен биоинформатический и  экспериментальный скрининг нРНК, направленных на сайты сплайсинга экзонов 43-55. В результате наиболее перспективными для редактирования подобным образом оказались акцепторные сайты сплайсинга экзонов 54-55 и донорные сайты сплайсинга экзонов 43 и 53. Кроме того
показана эффективность работы Cas9 с  неклассической PAM-последовательностью NGA.

1. Duan D., Goemans N., Takeda S. et al. Duchenne muscular dystrophy. Nat. Rev. Dis. Prim. England. 2021; 7(1): 13.

2. Bladen C.L., Salgado D., Monges S. et al. The TREAT-NMD DMD global database: Analysis of more than 7,000 duchenne muscular dystrophy mutations. Hum. Mutat. 2015;36(4):395-402.

3. Straub V., Guglieri M. An update on Becker muscular dystrophy. Curr. Opin. Neurol. England. 2023; 36(5): 450–454.

4. Chancellor D., Barrett D., Nguyen-Jatkoe L. et al. The state of cell and gene therapy in 2023. Mol. Ther. 2023; 31(12):3376-3388.

5. Hoy S.M. Delandistrogene Moxeparvovec: First Approval. Drugs. New Zealand. 2023; 83(14):1323-1329.

6. Monjaret F., Bourg N., Suel, L. et al. Cis-splicing and translation of the pre-trans-splicing molecule combine with efficiency in spliceosome-mediated RNA trans-splicing. Mol. Ther. 2014; 22(6):1176-1187.

7. Barthélémy F., Wein N., Krahn M. et al. Translational research and therapeutic perspectives in dysferlinopathies. Mol. Med. 2011; 17(9-10):875-882.

8. Athanasopoulos T., Munye M.M., Yáñez-Muñoz R.J. Nonintegrating Gene Therapy Vectors. Hematol Oncol Clin North Am. 2017; 31(5):753-770.

9. Izumi R., Takahashi T., Suzuki N. et al. The genetic profile of dysferlinopathy in a cohort of 209 cases: Genotype–phenotype relationship and a hotspot on the inner DysF domain. Hum. Mutat. 2020; 41(9):1540-1554.

10. Pierce E.A., Aleman T.S., Jayasundera K.T. et al. Gene Editing for CEP290-Associated Retinal Degeneration. N. Engl. J. Med. 2024; 390(21):1972–1984.

11. Gillmore J.D., Gane E., Taubel J. et al. CRISPR-Cas9 In Vivo Gene Editing for Transthyretin Amyloidosis. N. Engl. J. Med. 2021; 385(6):493-502.

12. Hu J.H., Miller S.M., Geurts M.H. et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 2018; 556(7699): 57-63.

13. Sambrook J., Russell D.W. Preparation and Transformation of Competent E. coli Using Calcium Chloride. CSH Protoc. United States. 2006 Jun 1;2006(1):pdb.prot3932. doi: 10.1101/pdb.prot3932.

14. Hsu P.D., Scott D.A., Weinstein J.A. et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat. Biotechnol. United States. 2013; 31(9): 827-832.

15. Doench J.G., Fusi N., Sullender M. et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPRCas9. Nat. Biotechnol. United States. 2016; 34(2): 184-191.

16. Zhang Y., Ge X., Yang F. et al. Comparison of non-canonical PAMs for CRISPR/Cas9-mediated DNA cleavage in human cells. Sci. ReС. 2014; 4: 1-5.

17. Wachutka L., Caizzi L., Gagneur J. et al. Global donor and acceptor splicing site kinetics in human cells. Elife. 2019; 8: 1-52.

18. Amoasii L., Long C., Li H. et al. Single-cut genome editing restores dystrophin expression in a new mouse model of muscular dystrophy. Sci. Transl. Med. 2017; 9(418):eaan8081.

19. Kondratyeva E., Bukharova T., Efremova A. et al. Health Characteristics of Patients with Cystic Fibrosis whose Genotype Includes a Variant of the Nucleotide Sequence c.3140-16T>A and Functional Analysis of this Variant. Genes (Basel). 2021;12(6): 837.

20. Min Y.L., Chemello F., Li H. et al. Correction of Three Prominent Mutations in Mouse and Human Models of Duchenne Muscular Dystrophy by Single-Cut Genome Editing. Mol. Ther. 2020;28(9):2044-2055.