Редактирование генома методом CRISPR/Cas для создания сублинии клеток рака легкого человека А549, нокаутной по гену р21

Технология CRISPR/Cas, являющаяся наиболее эффективной среди существующих методов редактирования генома, позволяет модифицировать таргетные участки молекулы ДНК и находит применение в различных отраслях биологии, генетики, сельского хозяйства, биотехнологии и медицины. С ее помощью создаются модели клеточных линий, необходимые для исследования роли определенных генов в развитии и терапии злокачественных и других заболеваний. Одним из таких генов является р21 (CDKN1A), регулируемый опухолевым супрессором р53 и негативно контролирующий прогрессию клеточного цикла. Неоднозначное влияние белка р21 на процессы канцерогенеза и ключевое участие в ответе клеток на терапию определяют его как перспективную мишень для исследований в этих областях. В нашей работе мы получили сублинию клеток рака легкого А549, нокаутную по гену р21, с помощью метода CRISPR/Cas, Ее использование планируется в экспериментах по изучению роли белка р21, а также опосредуемых им механизмов влияния других генов, в ответе клеток на терапию онкологических заболеваний, в частности, становлении фенотипа старения при применении низких доз терапии и выхода отдельных клеток из этой стадии (формирование рецидива опухоли), а также определении механизмов возникновения устойчивости опухолевых клеток.

1. Asmamaw M., Zawdie B. Mechanism and Applications of CRISPR/ Cas-9-Mediated Genome Editing. Biologics. 2021; 15: 353-361. doi: 10.2147/BTT.S326422.

2. Cai L., Fisher A. L., Huang H., Xie Z. CRISPR-mediated genome editing and human diseases. Genes Dis. 2016; 3: 244-251. doi: 10.1016/j.gendis.2016.07.003.

3. Stadtmauer E. A., Fraietta J. A., Davis M. M., et al. CRISPR- engineered T cells in patients with refractory cancer. Science. 2020; 367. doi: 10.1126/science.aba7365.

4. Li H., Yang Y., Hong W., Huang M., Wu M., Zhao X. Applications of genome editing technology in the targeted therapy of human diseases: mechanisms, advances and prospects. Signal Transduct Target Ther. 2020; 5: 1. doi: 10.1038/s41392-019-0089-y.

5. Katti A., Diaz B. J., Caragine C. M., Sanjana N. E., Dow L. E. CRISPR in cancer biology and therapy. Nat Rev Cancer. 2022; 22: 259-279. doi: 10.1038/s41568-022-00441-w.

6. Shamloo B., Usluer S. p21 in Cancer Research. Cancers (Basel). 2019; 11. doi: 10.3390/cancers11081178.

7. Georgakilas A. G., Martin O. A., Bonner W. M. p21: A Two-Faced Genome Guardian. Trends Mol Med/ 2017;23: 310-319. doi: 10.1016/j.molmed.2017.02.001.

8. Tsao Y. P., Huang S. J., Chang J. L., Hsieh J. T., Pong R. C., Chen S. L. Adenovirus-mediated p21((WAF1/SDII/CIP1)) gene transfer induces apoptosis of human cervical cancer cell lines. J Virol. 1999;73: 4983-4990. doi: 10.1128/JVI.73.6.4983-4990.1999.

9. Eastham J. A., Hall S. J., Sehgal I., et al. In vivo gene therapy with p53 or p21 adenovirus for prostate cancer. Cancer Res. 1995; 55: 5151-5155,

10. Gorospe M., Cirielli C., Wang X., Seth P., Capogrossi M. C., Holbrook N. J. p21(Waf1/Cip1) protects against p53-mediated apoptosis of human melanoma cells. Oncogene. 1997;14: 929-935. doi: 10.1038/sj.onc.1200897.

11. Jiang D., Wang X., Liu X., Li F. Gene delivery of cyclin-dependent kinase inhibitors p21Waf1 and p27Kip1 suppresses proliferation of MCF-7 breast cancer cells in vitro. Breast Cancer. 2014; 21: 614-623. doi: 10.1007/s12282-012-0438-y.

12. Zamkova M. A., Persiyantseva N. A., Tatarskiy V. V., Shti, A. A. Therapy-Induced Tumor Cell Senescence: Mechanisms and Circumvention. Biochemistry (Mosc). 2023;88: 86-104. doi: 10.1134/ S000629792301008X.

13. Roninson I. B. Tumor cell senescence in cancer treatment. Cancer Res. 2023;63: 2705-2715.

14. Cmielova J., Rezacova M. p21Cip1/Waf1 protein and its function based on a subcellular localization [corrected]. J Cell Biochem. 2011;112: 3502-3506. doi: 10.1002/jcb.23296.

15. Yosef R., Pilpel N., Papismadov N., et al. p21 maintains senescent cell viability under persistent DNA damage response by restraining JNK and caspase signaling. EMBO J. 2017;36: 2280-2295. doi: 10.15252/embj.201695553.

16. Park S. H., Park J. Y.,Weiss R. H. Antisense attenuation of p21 sensitizes kidney cancer to apoptosis in response to conventional DNA damaging chemotherapy associated with enhancement of phospho-p53. J Urol. 2008;180: 352-360. doi: 10.1016/j.juro.2008.02.038.

17. Rohnalter V., Roth K., Finkernagel F., et al. A multi-stage process including transient polyploidization and EMT precedes the emergence of chemoresistent ovarian carcinoma cells with a dedifferentiated and pro-inflammatory secretory phenotype. Oncotarget. 2015;6: 40005- 40025, doi: 10.18632/oncotarget.5552.

18. Giuliano C. J., Lin A., Girish V., Sheltzer J. M. Generating Single Cell-Derived Knockout Clones in Mammalian Cells with CRISPR/Cas9. Curr Protoc Mol Biol. 2019;128: e100. doi: 10.1002/cpmb.100.