Получение опухолевых линий A549 и MCF7 с нокаутом гена опухолевого супрессора TP53 с помощью CRISPR/Cas9

Опухолевой супрессор p53 является центральным звеном защиты клетки от злокачественной трансформации. Мутации кодирующего гена TP53 наблюдаются приблизительно в половине опухолей человека и способствуют не только опухолевой прогрессии, но также устойчивости или чувствительности к противоопухолевым препаратам. Получение изогенных линий, имеющих разный статус TP53, необходимо не только для исследования его роли, но и для скрининга новых противоопухолевых препаратов и их комбинаций. Получение изогенных моделей с помощью системы CRISPR/Cas9 часто связано с одноклеточным клонированием, что приводит к клональным эффектам из-за гетерогенности опухолевых культур. В данной работе описано получение новых нокаутов TP53 в линиях MCF7 и A549 с помощью системы CRISPR/Cas9 и отбора по устойчивости к нутлину-3, позволяющей отбирать нокаутные клетки без этапа клонального отбора. Фенотипически нокаут был подтвержден по полному отсутствию белка p53, снижению экспрессии p53-зависимого гена CDKN1A и изменению чувствительности к ДНК-повреждающим противоопухолевым препаратам.

1. Hassin O., Oren M. Drugging p53 in cancer: one protein, many targets. Nat. Rev. Drug Discov. 2023 Feb;22(2):127–44.

2. Nag S., Qin J., Srivenugopal K.S., et al. The MDM2-p53 pathway revisited. J. Biomed. Res. 2013 Jul;27(4):254–71.

3. Chène P. Inhibiting the p53-MDM2 interaction: an important target for cancer therapy. Nat. Rev. Cancer 2003 Feb;3(2):102–9.

4. Satyanarayana A., Hilton M.B., Kaldis P. p21 Inhibits Cdk1 in the absence of Cdk2 to maintain the G1/S phase DNA damage checkpoint. Mol. Biol. Cell 2008 Jan;19(1):65–77.

5. Aubrey B.J., Kelly G.L., Janic A., et al. How does p53 induce apoptosis and how does this relate to p53-mediated tumour suppression? Cell Death Differ. 2018 Jan;25(1):104–13.

6. Hainaut P., Pfeifer G.P. Somatic TP53 Mutations in the Era of Genome Sequencing. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2016 Nov 1; 6(11).

7. Tate J.G., Bamford S., Jubb H.C., et al. COSMIC: the Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer. Nucleic Acids Res. 2019 Jan 8;47(D1):D941–7.

8. Wang H., Guo M., Wei H., et al. Targeting p53 pathways: mechanisms, structures, and advances in therapy. Signal Transduct Target Ther 2023 Mar 1;8(1):92.

9. Willis A., Jung E.J., Wakefield T., et al. Mutant p53 exerts a dominant negative effect by preventing wild-type p53 from binding to the promoter of its target genes. Oncogene 2004 Mar 25;23(13):2330–8.

10. Wang B., Xiao Z., Ren E.C. Redefining the p53 response element. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2009 Aug 25;106(34):14373–8.

11. Pfister N.T., Fomin V., Regunath K., et al. Mutant p53 cooperates with the SWI/SNF chromatin remodeling complex to regulate VEGFR2 in breast cancer cells. Genes Dev. 2015 Jun 15;29(12):1298–315.

12. Alvarado-Ortiz E., de la Cruz-López K.G., Becerril-Rico J., et al. Mutant p53 Gain-of-Function: Role in Cancer Development, Progression, and Therapeutic Approaches. Front Cell Dev Biol 2020;8:607670.

13. Wong R.P.C., Tsang W.P., Chau P.Y., et al. p53-R273H gains new function in induction of drug resistance through down-regulation of procaspase-3. Mol. Cancer Ther. 2007 Mar;6(3):1054–61.

14. Tung M.-C., Lin P.-L., Wang Y.-C., et al. Mutant p53 confers chemoresistance in non-small cell lung cancer by upregulating Nrf2. Oncotarget 2015 Dec 8;6(39):41692–705.

15. Cao X., Hou J., An Q., et al. Towards the overcoming of anticancer drug resistance mediated by p53 mutations. Drug Resist. Updat. 2020 Mar;49:100671.

16. Park S.-H., Seong M.-A., Lee H.-Y. p38 MAPK-induced MDM2 degradation confers paclitaxel resistance through p53-mediated regulation of EGFR in human lung cancer cells. Oncotarget 2016 Feb 16;7(7):8184–99.

17. Steels E., Paesmans M., Berghmans T., et al. Role of p53 as a prognostic factor for survival in lung cancer: a systematic review of the literature with a meta-analysis. Eur. Respir. J. 2001 Oct;18(4):705–19.

18. Ungerleider N.A., Rao S.G., Shahbandi A., et al. Breast cancer survival predicted by TP53 mutation status differs markedly depending on treatment. Breast Cancer Res. 2018 Oct 1;20(1):115.

19. Ran F.A., Hsu P.D., Wright J., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 2013 Nov;8(11):2281–308.

20. Duffy M.J., Synnott N.C., O’Grady S., et al. Targeting p53 for the treatment of cancer. Semin. Cancer Biol. 2022 Feb;79:58–67.