Редактирование мутации c.3846G>A (p.Trp1282*) в гене CFTR в ИПСК с использованием аденинового редактора

Муковисцидоз (МВ) – аутосомно-рецессивное заболевание, обусловленное мутациями в гене CFTR, приводящими к дисбалансу ионов хлора и натрия в эпителиальных клетках различных органов. Нонсенс-мутации в гене CFTR описаны у 10% пациентов с МВ, при этом наиболее частой нонсенс-мутацией является c.3846G>A (p.Trp1282*, W1282X). Известно, что современная патогенетическая терапия МВ CFTR-модуляторами не эффективна в отношении этого класса мутаций, поэтому пациенты с нонсенс- мутациями в гене CFTR до сих пор остаются без эффективного лечения. Этиотропная терапия МВ может быть разработана на основе новейших методов геномного редактирования, например, с использованием редакторов оснований, позволяющих точечно изменять нуклеотиды в геноме. Адениновый редактор оснований позволяет целенаправленно корректировать нонсенс- мутации. Целью работы явилась оценка эффективности коррекции мутации c.3846G>A в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках (ИПСК) пациента с МВ с помощью аденинового редактора оснований. В работе использован редактор xCas9(3.7)-ABE(7.10) в сочетании с гидовой РНК (в отдельной плазмиде B52-1282), позволяющей редактору конвертировать c.3846A>G. Плазмиды были трансфицированы электропорацией в ИПСК с генотипом F508del/c.3846G>A в гене CFTR. Оценку эффективности коррекции проводили спустя 48 часов путём глубокого таргетного секвенирования. Результаты работы показали, что частота конверсии нуклеотида c.3846А>G составила 10,9% аллелей. При этом частота нежелательных изменений (инделов) в локусе редактирования не превышала таковую в нетрансфицированном контроле. Таким образом, в работе показано, что адениновый редактор оснований xCas9(3.7)-ABE(7.10) позволяет корректировать мутацию c.3846G>A в гене CFTR в 10,9% аллелей в ИПСК больного МВ без внесения дополнительных мутаций в локус редактирования.

1. Shteinberg M., Haq I.J., Polineni D., Davies J.C. Cystic fibrosis. Lancet. 2021 Jun 5;397(10290):2195-2211. doi: 10.1016/S01406736(20)32542-3

2. Lopes-Pacheco M. CFTR Modulators: The Changing Face of Cystic Fibrosis in the Era of Precision Medicine. Front Pharmacol. 2020 Feb 21;10:1662. doi: 10.3389/fphar.2019.01662

3. Zainal Abidin N., Haq I.J., Gardner A.I., Brodlie M. Ataluren in cystic fibrosis: development, clinical studies and where are we now? Expert Opin Pharmacother. 2017 Sep;18(13):1363-1371. doi: 10.1080/14656566.2017.1359255

4. Doudna J.A. The promise and challenge of therapeutic genome editing. Nature. 2020 Feb;578(7794):229-236. doi: 10.1038/s41586020-1978-5

5. Anzalone A.V., Koblan L.W., Liu D.R. Genome editing with CRISPRCas nucleases, base editors, transposases and prime editors. Nat Biotechnol. 2020 Jul;38(7):824-844. doi: 10.1038/s41587-020-0561-9

6. Komor A.C., Kim Y.B., Packer M.S., Zuris J.A., Liu .DR. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 2016 May 19;533(7603):4204. doi: 10.1038/nature17946

7. Gaudelli N.M., Komor A.C., Rees H.A., Packer M.S., Badran A.H., Bryson D.I., Liu D.R. Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature. 2017 Nov 23;551(7681):464-471. doi: 10.1038/nature24644

8. Lavrov A.V., Varenikov G.G., Skoblov M.Y. Genome scale analysis of pathogenic variants targetable for single base editing. BMC Med Genomics. 2020 Sep 18;13(Suppl 8):80. doi: 10.1186/s12920-020-00735-8

9. Petrova N., Balinova N., Marakhonov A., Vasilyeva T., Kashirskaya N., Galkina V., Ginter E., Kutsev S., Zinchenko R. Ethnic Differences in the Frequency of CFTR Gene Mutations in Populations of the European and North Caucasian Part of the Russian Federation. Front Genet. 2021 Jun 16;12:678374. doi: 10.3389/fgene.2021.678374

10. Регистр пациентов с муковисцидозом в Российской Федерации. 2020 год. Под редакцией Е.И. Кондратьевой, С.А. Красовского, М.А. Стариновой, А.Ю. Воронковой, Е.Л. Амелиной, Н.Ю. Каширской, С.Н. Авдеева, С.И. Куцева. Москва: МЕДПРАКТИКА-М, 2022. 68 с.

11. Kondrateva E., Demchenko A., Slesarenko Y,. Pozhitnova V., Yasinovsky M., Amelina E., Tabakov V., Voronina E., Lavrov A., Smirnikhina S. Generation of two induced pluripotent stem cell lines (RCMGi004-A and -B) from human skin fibroblasts of a cystic fibrosis patient with compound heterozygous F508del/W1282X mutations. Stem Cell Research 2021; 52: 102232. DOI: 10.1016/j.scr.2021.102232

12. Hwang G.H., Park J., Lim K., Kim S., Yu J., Yu E., Kim S.T., Eils R., Kim J.S., Bae S. Web-based design and analysis tools for CRISPR base editing. BMC Bioinformatics. 2018 Dec 27;19(1):542. doi: 10.1186/s12859-018-2585-4

13. Clement K., Rees H., Canver M.C., Gehrke J.M., Farouni R., Hsu J.Y., Cole M.A., Liu D.R., Joung J.K., Bauer D.E., Pinello L. CRISPResso2 provides accurate and rapid genome editing sequence analysis. Nat Biotechnol. 2019 Mar; 37(3):224-226. doi: 10.1038/s41587-019-0032-3

14. Hu J.H., Miller S.M., Geurts M.H., Tang W., Chen L., Sun N., Zeina C..M, Gao X., Rees H.A., Lin Z., Liu D.R. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 2018 Apr 5;556(7699):57-63. doi: 10.1038/nature26155

15. Rees H.A., Liu D.R. Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells. Nat Rev Genet. 2018 Dec;19(12):770-788. doi: 10.1038/s41576-018-0059-1

16. Wilschanski M. Class 1 CF Mutations. Front Pharmacol. 2012 Jun 20;3:117. doi: 10.3389/fphar.2012.00117

17. Demchenko A., Kondrateva E., Tabakov V., Efremova A., Salikhova D., Bukharova T., Goldshtein D., Balyasin M., Bulatenko N., Amelina E., Lavrov A., Smirnikhina S. Airway and Lung Organoids from HumanInduced Pluripotent Stem Cells Can Be Used to Assess CFTR Conductance. Int. J. Mol. Sci. 2023, 24, 6293. https://doi.org/10.3390/ijms24076293

18. Maxwell K.G., Millman J.R. Applications of iPSC-derived beta cells from patients with diabetes. Cell Rep Med. 2021 Apr 20;2(4):100238. doi: 10.1016/j.xcrm.2021.100238

19. Fleischer A., Vallejo-Díez S., Martín-Fernández J.M., SánchezGilabert A., Castresana M., Del Pozo A., Esquisabel A., Ávila S., Castrillo J.L., Gaínza E., Pedraz J.L., Viñas M., Bachiller D. iPSCDerived Intestinal Organoids from Cystic Fibrosis Patients Acquire CFTR Activity upon TALEN-Mediated Repair of the p.F508del Mutation. Mol Ther Methods Clin Dev. 2020 Apr 18;17:858-870. doi: 10.1016/j.omtm.2020.04.005

20. Palmer D.J., Turner D.L., Ng P. A Single «All-in-One» HelperDependent Adenovirus to Deliver Donor DNA and CRISPR/ Cas9 for Efficient Homology-Directed Repair. Mol Ther Methods Clin Dev. 2020 Feb 4;17:441-447. doi: 10.1016/j.omtm.2020.01.014

21. Suzuki S., Chosa K., Barillà C., Yao M., Zuffardi O., Kai H., Shuto T., Suico M.A., Kan Y.W., Sargent R.G., Gruenert D.C. Seamless Gene Correction in the Human Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Locus by Vector Replacement and Vector Insertion Events. Front Genome Ed. 2022 Apr 6;4:843885. doi: 10.3389/fgeed.2022.843885

22. Johnson L.G., Olsen J.C., Sarkadi B., Moore K.L., Swanstrom R., Boucher R.C. Efficiency of gene transfer for restoration of normal airway epithelial function in cystic fibrosis. Nat Genet. 1992 Sep;2(1):21-5. doi: 10.1038/ng0992-21

23. Geurts M.H., de Poel E., Amatngalim G.D., et al. CRISPR-Based Adenine Editors Correct Nonsense Mutations in a Cystic Fibrosis Organoid Biobank [published online ahead of print, 2020 Feb 13]. Cell Stem Cell. 2020;S1934-5909(20)30019-9. doi:10.1016/j.stem.2020.01.019

24. Krishnamurthy S., Traore S., Cooney A.L., Brommel C.M., Kulhankova K., Sinn P.L., Newby GA, Liu DR, McCray PB. Functional correction of CFTR mutations in human airway epithelial cells using adenine base editors. Nucleic Acids Res. 2021 Oct 11;49(18):10558-10572. doi: 10.1093/nar/gkab788

25. Chiavetta R.F., Titoli S., Barra V., Cancemi P., Melfi R., Di Leonardo A. Site-Specific RNA Editing of Stop Mutations in the CFTR mRNA of Human Bronchial Cultured Cells. Int J Mol Sci. 2023 Jun 30;24(13):10940. doi: 10.3390/ijms241310940

26. Melfi R., Cancemi P., Chiavetta R., Barra V., Lentini L., Di Leonardo A. Investigating REPAIRv2 as a Tool to Edit CFTR mRNA with Premature Stop Codons. Int J Mol Sci. 2020 Jul 6;21(13):4781. doi: 10.3390/ijms21134781

27. Cuevas-Ocaña S., Yang J.Y., Aushev M., Schlossmacher G., Bear C.E., Hannan N.R.F., Perkins N.D., Rossant J., Wong A.P., Gray M.A. A Cell-Based Optimised Approach for Rapid and Efficient Gene Editing of Human Pluripotent Stem Cells. Int J Mol Sci. 2023 Jun 17;24(12):10266. doi: 10.3390/ijms241210266

28. Erwood S., Laselva O., Bily T.M.I., Brewer R.A., Rutherford A.H., Bear C.E., Ivakine E.A. Allele-Specific Prevention of Nonsense-Mediated Decay in Cystic Fibrosis Using Homology-Independent Genome Editing. Mol Ther Methods Clin Dev. 2020 May 12;17:11181128. doi: 10.1016/j.omtm.2020.05.002

29. Santos L., Mention K., Cavusoglu-Doran K., Sanz D.J., Bacalhau M., Lopes-Pacheco M., Harrison P.T., Farinha C.M. Comparison of Cas9 and Cas12a CRISPR editing methods to correct the W1282X-CFTR mutation. J Cyst Fibros. 2021 Jun 5:S15691993(21)00167-3. doi: 10.1016/j.jcf.2021.05.014