Метод анализа метилирования CpG-островка, принадлежащего промоторной области гена MGMT, с использованием таргетного клонального бисульфитного секвенирования ДНК нового поколения

Проведено сравнение методов секвенирования по Сэнгеру, секвенирования нового поколения и метилчувствительной ПЦР (МЧПЦР) с целью определения метилированного состояния целевого локуса. Обсуждается клиническая значимость получаемых расхождений в приложении к определению статуса метилирования промоторной области гена MGMT при глиобластоме. Показано, что для МЧ-ПЦР характерны ложноотрицательные результаты, а также сложна оценка низких уровней метилирования, не имеющих клинической значимости. Секвенирование по Сэнгеру не даёт возможности профилирования отдельных клеточных клонов, требует отдельного программного обеспечения для количественной оценки метилирования. Для рутинной лабораторной практики предложена технология таргетного клонального бисульфитного секвенирования ДНК с использованием метода секвенирования нового поколения для определения статуса метилирования CpG-островка, включающего в свой состав промоторную область гена MGMT. Рекомендовано использование прибора Ion Torrent PGM для избегания расчёта поправочных коэффициентов на определение смещения уровня метилирования.

1. Ostrom Q.T., Patil N., Cioffi G., Waite K., Kruchko C., Barnholtz-Sloan J.S. CBTRUS Statistical Report: Primary Brain and Other Central Nervous System Tumors Diagnosed in the United States in 2013-2017. Neuro Oncol. 2020;22(12 Suppl 2):iv1-iv96. doi: 10.1093/neuonc/noaa200.

2. Kotecha R., Odia Y., Khosla A.A., Ahluwalia M.S. Key Clinical Principles in the Management of Glioblastoma. JCO Oncol Pract. 2023;19(4):180-189. doi: 10.1200/OP.22.00476.

3. Hegi M.E., Diserens A.C., Gorlia T., et al: MGMT gene silencing and benefit from temozolomide in glioblastoma. N Engl J Med. 2005; 352:997-1003.

4. Liu D., Yang T., Ma W., Wang Y. Clinical strategies to manage adult glioblastoma patients without MGMT hypermethylation. J Cancer. 2022;13(1):354-363. doi: 10.7150/jca.63595.

5. Dupont J.-M., Tost J., Jammes H., Gut I.G. De novo quantitative bisulfite sequencing using the pyrosequencing technology. Anal Biochem. 2004;333:119–27, doi: 10.1016/j.ab.2004.05.007.

6. Mikeska T., Bock C., El-Maarri O., Hubner A., Ehrentraut D., Schramm J., et al. Optimization of quantitative MGMT promoter methylation analysis using pyrosequencing and combined bisulfite restriction analysis. J Mol Diagn. 2007;9:368–81, doi: 10.2353/jmoldx.2007.060167.

7. Johannessen L.E., Brandal P., Myklebust T.Å., et al. MGMT gene promoter methylation status – Assessment of two pyrosequencing kits and three methylation-specific PCR methods for their predictive capacity in glioblastomas. Cancer Genomics and Proteomics. 2018; 15:437–446.

8. Lattanzio L., Borgognone M., Mocellini C., et al. MGMT promoter methylation and glioblastoma: A comparison of analytical methods and of tumor specimens. Int J Biol Markers. 2015; 30:e208– e216.

9. Hegi M.E., Genbrugge E., Gorlia T., et al. MGMT Promoter Methylation Cutoff with Safety Margin for Selecting Glioblastoma Patients into Trials Omitting Temozolomide: A Pooled Analysis of Four Clinical Trials. Clin Cancer Res. 2018; 25:1809–1816.

10. Estival A., Sanz C., Ramirez J.L., et al. Pyrosequencing versus methylation-specific PCR for assessment of MGMT methylation in tumor and blood samples of glioblastoma patients. Sci Rep. 2019; 9:11125.

11. Della Monica R., Cuomo M., Buonaiuto M., et al. MGMT and Whole-Genome DNA Methylation Impacts on Diagnosis, Prognosis and Therapy of Glioblastoma Multiforme. Int J Mol Sci. 2022;23(13):7148. doi: 10.3390/ijms23137148.

12. Танас А.С., Симонова О.А., Абрамычева Н.Ю., Стрельников В.В. Совершенствование анализа результатов секвенирования ДНК по Сэнгеру: компьютерная программа SEQBASE. Медицинская генетика. 2021; 20(10):33-39, DOI: 10.25557/2073-7998.2021.10.33-39

13. Li L.C., Dahiya R. MethPrimer: designing primers for methylation PCRs. Bioinformatics. 2002;18(11):1427-31. doi: 10.1093/bioinformatics/18.11.1427.

14. Tanas A.S., Borisova M.E., Kuznetsova E.B., et al. Rapid and affordable genome-wide bisulfite DNA sequencing by XmaI-reduced representation bisulfite sequencing. Epigenomics. 2017; 9(6): 833-847.