Представленность явления «выпадения» аллеля в результатах секвенирования

Все ПЦР-опосредованные методы секвенирования имеют риск возникновения явления «выпадения» аллеля (allelic dropout, ADO), которое приводит к селективной амплификации аллелей в ходе ПЦР и может снижать диагностическую эффективность генетического тестирования. Для выявления случаев ADO нами было проведено сравнение файлов ВАМ, VCF с хроматограммами прямого секвенирования по Сэнгеру. Для выявления причин ADO анализировали сайты связывания праймеров с использованием базы данных gnomAD. Ампликоны со случаями потенциального ADO были ресеквенированы с альтернативной пары праймеров. Были выявлены 8 случаев ADO как в результатах NGS (таргетные панели генов), так и прямого секвенирования по Сэнгеру. Факт избирательной амплификации аллелей был подтвержден во всех представленных случаях при ресеквенировании с альтернативной пары праймеров. Большинство случаев ADO (6 случаев, 75%) были вызваны частыми или редкими однонуклеотидными генетическими вариантами в местах отжига олигопраймеров, в двух случаях (25%) ADO было предположительно опосредовано присутствием инделов длиной 6 и более нуклеотидов в исследуемых ампликонах. Кроме того, в ряде ампликонов мы обнаружили «недопредставленность» SNVs на ридах NGS либо наличие интересующего SNV только в ридах одного ампликона из двух. Учитывая случаи доказанного и потенциального ADO, мы полагаем, что дизайн олигопраймеров без учета ADO может влиять на эффективность амплификации до 0,85% ампликонов.

«выпадение» аллеля, ДНК-диагностика, секвенирование нового поколения, NGS, однонуклеотидный генетический вариант

1. Jeong T.D., Cho S.Y., Kim M.W., Huh J. Significant allelic dropout phenomenon of oncomine BRCA research assay on Ion torrent S5. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 2019; 57(6):e124-e127. doi: 10.1515/cclm-2018-0674

2. Blais J., Lavoie S.B., Giroux S., Bussières J., Lindsay C., Dionne J., Laroche M., Giguère Y., Rousseau F. Risk of misdiagnosis due to allele dropout and false-positive PCR artifacts in molecular diagnostics analysis of 30,769 genotypes. J Mol Diagn. 2015; 17(5):505-14. doi: 10.1016/j.jmoldx.2015.04.004

3. Wang C., Schroeder K.B., Rosenberg N.A. A maximum-likelihood method to correct for allelic dropout in microsatellite data with no replicate genotypes. Genetics. 2012; 192(2):651-69. doi: 10.1534/genetics.112.139519

4. Martins E. M., Vilarinho L., Esteves S., Lopes-Marques M., Amorim A., Azevedo L. Consequences of primer binding-sites polymorphisms on genotyping practice. Open J. Genet. 2011; 1:15-17. doi: 10.4236/ojgen.2011.12004

5. Lam C.W., Mak C.M. Allele dropout caused by a non-primer-site SNV affecting PCR amplification - A call for next-generation primer design algorithm. Clinica Chimica Acta. 2013; 421:208-12. doi: 10.1016/j.cca.2013.03.014