Оптимизация условий трансфекции клеточной культуры CFTE29o -  для разработки редактирования мутации F508del в гене  CFTR

С. А. Смирнихина; А. В. Банников; А. В. Лавров

doi:10.1234/XXXX-XXXX-2016-8-36-39

Оптимизация условий трансфекции клеточной культуры CFTE29o^- для разработки редактирования мутации F508del в гене CFTR

С. А. Смирнихина, А. В. Банников, А. В. Лавров

https://doi.org/10.1234/XXXX-XXXX-2016-8-36-39

Полный текст:

PDF (Rus)

Аннотация

Технологии геномного редактирования, включая недавно появившийся метод CRISPR/Cas9, являются наиболее перспективными для разработки этиотропного лечения муковисцидоза. Для доставки компонентов системы CRISPR/Cas9 в клетки обычно используют традиционные методы трансфекции. Целью данной работы была оптимизация невирусной доставки плазмиды pEGFP-N1 в клетки трахеального эпителия человека CFTE29o^- с гомозиготной мутацией F508del. Эффективность липофекции различными реагентами, Metafectene, Metafectene Pro, Unifectine-56 и Maxifectine-56, была низкой и плохо воспроизводимой. Электропорация, даже при «мягких» условиях, приводила к высокой смертности клеток. Подходящим методом для CFTE29o^- оказалась кальций-фосфатная трансфекция, эффективность которой составила 46,3-48,0%. Высокая эффективность метода позволяет трансфицировать плазмиды CRISPR/Cas9 для их дальнейшей сравнительной характеристики в целях оптимизации геномного редактирования F508del в гене CFTR .

Ключевые слова

CFTE29o^-, кальций-фосфатная трансфекция, липофекция, электропорация, GFP, CFTE29o^-, Electroporation, Transfection, Gene Transfer Techniques, Green Fluorescent Proteins

Об авторах

С. А. Смирнихина

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Медико-генетический научный центр»
Россия

А. В. Банников

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Медико-генетический научный центр»
Россия

А. В. Лавров

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Медико-генетический научный центр»; Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова
Россия

Список литературы

1. Whiting P, Al M, Burgers L, et al. Ivacaftor for the treatment of patients with cystic fibrosis and the G551D mutation: a systematic review and cost-effectiveness analysis. Health Technol Assess. 2014 Mar;18(18):1-106.

2. Mayer M. Lumacaftor-ivacaftor (Orkambi) for cystic fibrosis: behind the ‘breakthrough’. Evid Based Med. 2016 Jun;21(3):83-86.

3. Cholon DM, Esther CR Jr, Gentzsch M. Efficacy of lumacaftor-ivacaftor for the treatment of cystic fibrosis patients homozygous for the F508del-CFTR mutation. Expert Rev Precis Med Drug Dev. 2016;1(3):235-243.

4. Kim YG, Cha J, Chandrasegaran S. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 Feb 6;93(3):1156-1160.

5. Cermak T, Doyle EL, Christian M, et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res. 2011 Jul;39(12):e82.

6. Zhang F, Wen Y, Guo X. CRISPR/Cas9 for genome editing: progress, implications and challenges. Hum Mol Genet. 2014 Sep 15;23(R1):R40-46.

7. Ran FA, Hsu PD, Wright J, et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 2013 Nov;8(11):2281-2308.

8. Bobadilla JL, Macek M Jr, Fine JP, Farrell PM. Cystic fibrosis: a worldwide analysis of CFTR mutations-correlation with incidence data and application to screening. Hum Mutat. 2002 Jun;19(6):575-606.

9. Kaestner L, Scholz A, Lipp P. Conceptual and technical aspects of transfection and gene delivery. Bioorg Med Chem Lett. 2015 Mar 15;25(6):1171-1176.

10. Graham FL, van der Eb AJ. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology. 1973 Apr;52(2):456-467.

11. Kunzelmann K, Schwiebert EM, Zeitlin PL, Kuo WL, Stanton BA, Gruenert DC. An immortalized cystic fibrosis tracheal epithelial cell line homozygous for the delta F508 CFTR mutation. Am J Respir Cell Mol Biol. 1993 May;8(5):522-529.

Рецензия

Для цитирования:

Смирнихина С.А., Банников А.В., Лавров А.В. Оптимизация условий трансфекции клеточной культуры CFTE29o^- для разработки редактирования мутации F508del в гене CFTR. Медицинская генетика. 2016;15(8):36-39. https://doi.org/10.1234/XXXX-XXXX-2016-8-36-39

For citation:

Smirnikhina S.A., Bannikov A.V., Lavrov A.V. Optimization of transfection for CFTE29o^- cell culture to develop editing of F508del mutation in CFTR gene. Medical Genetics. 2016;15(8):36-39. (In Russ.) https://doi.org/10.1234/XXXX-XXXX-2016-8-36-39

Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.

ISSN 2073-7998 (Print)

Логин
Пароль
	Запомнить меня

Войти

Медицинская генетика

Оптимизация условий трансфекции клеточной культуры CFTE29o- для разработки редактирования мутации F508del в гене CFTR