medgenМедицинская генетикаMedical Genetics2073-7998Publishing House «Genius Media» LLC10.1234/XXXX-XXXX-2016-1-43-50medgen-91Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯORIGINAL RESEARCHМетод анализа числа копий GC-богатых повторяющихся последовательностей генома в составе поврежденной ДНК. Определение увеличенного содержания рибосомных генов в циркулирующей внеклеточной ДНК лиц с длительным стажем курения табакаThe method for analysis of the copy number variations of GC-rich repeat of human genome in damaged DNA. Detection of increasing copy number of ribosomal genes in extracellular DNA circulating in blood plasma of smokers` humansЧестковИ. В.ChestkovI. V.ichestkov@yandex.ruВейкоН. Н.VeikoN. N.noemail@neicon.ruЕршоваЕ. С.ErshovaL. S.noemail@neicon.ruСергееваВ. А.SergeevaV. A.noemail@neicon.ruВейкоР. В.VeikoR. V.noemail@neicon.ruИжевскаяВ. Л.IzhevskayaV. L.noemail@neicon.ruКостюкС. В.KostuykS. V.noemail@neicon.ruФГБНУ «Медико-генетический научный центр»РоссияFederal State Budgetary Institution «Research Centre for Medical Genetics»Russian Federation2016071020161514350Copyright © Честков И.В., Вейко Н.Н., Ершова Е.С., Сергеева В.А., Вейко Р.В., Ижевская В.Л., Костюк С.В., 20162016Честков И.В., Вейко Н.Н., Ершова Е.С., Сергеева В.А., Вейко Р.В., Ижевская В.Л., Костюк С.В.Chestkov I.V., Veiko N.N., Ershova L.S., Sergeeva V.A., Veiko R.V., Izhevskaya V.L., Kostuyk S.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.medgen-journal.ru/jour/article/view/91

Анализ GC-богатых повторов в составе поврежденной ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) дает сильно заниженные значения их содержания в геноме. Описана технология, позволяющая анализировать копийность умеренных GC-богатых повторов генома человека (рибосомного, теломерного и митохондриальной ДНК) в составе поврежденной ДНК. По сравнению с другими, эти последовательности генома наиболее сильно повреждаются в составе внеклеточной ДНК, в ДНК старых клеток, в длительно хранящихся образцах ДНК и в окисленной ДНК. В основе технологии лежат метод нерадиоактивной количественной гибридизации с битинированными ДНК-зондами и специально написанная программа расчета содержания повтора в геноме на основе автоматического анализа экспериментальных данных. Применение технологии проиллюстрировано на примере сравнительного анализа содержания рибосомного повтора в составе внеклеточной ДНК плазмы крови курящих и некурящих лиц. Показано, что в плазме крови людей с длительным стажем курения накапливаются в значительном количестве фрагменты рибосомного повтора, что может указывать на усиление процессов гибели клеток в организме и на развитие хронической патологии.

Detection of copy number variations of GC-rich repeated sequences in the structure of damaged DNA by PCR method results in significant understatement of their quantity in genome. We have described the method for analysis of the copy number variations of GC-rich repeat of human genome (mitochondrial, ribosomal and telomeric repeat) in damaged DNA. Comparing to others, these sequences of genome are mostly damaged in extracellular DNA, in DNA of the old cells, in long-stored DNA-samples and in oxidized DNA. The technology is based on the method of non-radioactive quantified dot hybridization with biotin-labeled DNA-probes and on the software designed specially to calculate the copy number of ribosomal genes (genes for rRNA) in extracellular DNA circulating in blood plasma of smokers’ and non-smokers’ humans. We have shown that fragments of GC-rich ribosomal repeat accumulate in extracellular DNA of chronically smoking people, which can be a sign of the intensification of necrotic processes in cells and of the chronic pathology development.

рибосомный повторанализ копийностивнеклеточная ДНКнерадиоактивная гибридизацияribosomal repeatcopy number variationextracellular DNAnon-radioactive hybridizationReferencesВейко Н.Н., Булычева Н.В., Рогинко О.А., Вейко Р.В., Ершова Е.С., Коздоба О.А., Кузьмин В.А., Виноградов А.М., Юдин А.А., Сперанский А.И. Фрагменты транскрибируемой области рибосомного повтора в составе внеклеточной ДНК - маркер гибели клеток организма // Биомедицинская химия. - 2008. - Т. 54, № 1. - С. 78-93.Вейко Н.Н., Булычева Н.В., Рогинко О.А., Вейко Р.В., Ершова Е.С., Коздоба О.А., Кузьмин В.А., Виноградов А.М., Юдин А.А., Сперанский А.И. Фрагменты транскрибируемой области рибосомного повтора в составе внеклеточной ДНК - маркер гибели клеток организма // Биомедицинская химия. - 2008. - Т. 54, № 1. - С. 78-93.Вейко Н.Н., Еголина Н.А., Радзивил Г.Г., Нурбаев С.Д., Косякова Н.В., Шубаева Н.О., Ляпунова Н.А. Количественное определение повторяющихся последовательностей в геномной ДНК человека. Обнаружение увеличенного количества рибосомных повторов в геномах больных шизофренией (результаты молекулярного и цитогенетического анализов) // Молекулярная биология. - 2003. - Т. 37, № 3. - С. 409-419.Вейко Н.Н., Еголина Н.А., Радзивил Г.Г., Нурбаев С.Д., Косякова Н.В., Шубаева Н.О., Ляпунова Н.А. Количественное определение повторяющихся последовательностей в геномной ДНК человека. Обнаружение увеличенного количества рибосомных повторов в геномах больных шизофренией (результаты молекулярного и цитогенетического анализов) // Молекулярная биология. - 2003. - Т. 37, № 3. - С. 409-419.Вейко Н.Н., Шубаева Н.О., Иванова С.М., Сперанский А.И., Ляпунова Н.А., Спитковский Д.М. ДНК сыворотки крови больных ревматоидным артритом значительно обогащена фрагментами рибосомных повторов, содержащих иммуностимулирующие CpG-мотивы // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2006. - № 9. - С. 282-285.Вейко Н.Н., Шубаева Н.О., Иванова С.М., Сперанский А.И., Ляпунова Н.А., Спитковский Д.М. ДНК сыворотки крови больных ревматоидным артритом значительно обогащена фрагментами рибосомных повторов, содержащих иммуностимулирующие CpG-мотивы // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2006. - № 9. - С. 282-285.Ефремова Л.В., Алексеева А.Ю., Конькова М.С., Костюк С.В., Ершова Е.С., Смирнова Т.Д., Конорова И.Л., Вейко Н.Н. Внеклеточная ДНК влияет на количество NO в эндотелиальных клетках человека // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2010. - Т. 149, № 2. - С. 196-200.Ефремова Л.В., Алексеева А.Ю., Конькова М.С., Костюк С.В., Ершова Е.С., Смирнова Т.Д., Конорова И.Л., Вейко Н.Н. Внеклеточная ДНК влияет на количество NO в эндотелиальных клетках человека // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2010. - Т. 149, № 2. - С. 196-200.Костюк С.В., Ершова Е.С., Вейко Н.Н. Хроническое действие ионизирующего излучения вызывает значительное снижение концентрации циркулирующей ДНК плазмы крови // Медицинская генетика. - 2013. - Т. 12, № 11 (137). - С. 29-35.Костюк С.В., Ершова Е.С., Вейко Н.Н. Хроническое действие ионизирующего излучения вызывает значительное снижение концентрации циркулирующей ДНК плазмы крови // Медицинская генетика. - 2013. - Т. 12, № 11 (137). - С. 29-35.Малиновская Е.М., Смирнова Т.Д., Еголина Н.А., Цветкова Т.Г., Косякова Н.В., Мандрон И.А., Мхитарова Е.В., Костюк С.В., Терехов С.М., Местергази Г.М., Вейко Н.Н., Ляпунова Н.А. Изменение комплекса рибосомных генов человека при старении // Медицинская генетика. - 2008. - Т. 7, № 2. - С. 10-16.Малиновская Е.М., Смирнова Т.Д., Еголина Н.А., Цветкова Т.Г., Косякова Н.В., Мандрон И.А., Мхитарова Е.В., Костюк С.В., Терехов С.М., Местергази Г.М., Вейко Н.Н., Ляпунова Н.А. Изменение комплекса рибосомных генов человека при старении // Медицинская генетика. - 2008. - Т. 7, № 2. - С. 10-16.Bulicheva N., Fidelina O., Mkrtumova N., Neverova M., Bogush A., Bogush M., Roginko O., Veiko N. Effect of cell-free DNA of patients with cardiomyopathy and rDNA on the frequency of contraction of electrically paced neonatal rat ventricular myocytes in culture // Ann. N.Y. Acad. Sci. - 2008. - Vol. 1137. - P. 273-277.Bulicheva N., Fidelina O., Mkrtumova N., Neverova M., Bogush A., Bogush M., Roginko O., Veiko N. Effect of cell-free DNA of patients with cardiomyopathy and rDNA on the frequency of contraction of electrically paced neonatal rat ventricular myocytes in culture // Ann. N.Y. Acad. Sci. - 2008. - Vol. 1137. - P. 273-277.Carnevale R., Sciarretta S., Violi F., Nocella C., Loffredo L., Perri L., Peruzzi M., Marullo A.G., De Falco E., Chimenti I., Valenti V., Biondi-Zoccai G., Frati G. Acute impact of tobacco versus electronic cigarette smoking on oxidative stress and vascular function // Chest. - 2016. - Vol. S0012-3692, № 16. - P. 48562-4.Carnevale R., Sciarretta S., Violi F., Nocella C., Loffredo L., Perri L., Peruzzi M., Marullo A.G., De Falco E., Chimenti I., Valenti V., Biondi-Zoccai G., Frati G. Acute impact of tobacco versus electronic cigarette smoking on oxidative stress and vascular function // Chest. - 2016. - Vol. S0012-3692, № 16. - P. 48562-4.Ermakov A.V., Konkova M.S., Kostyuk S.V., Izevskaya V.L., Baranova A., Veiko N.N. Oxidized extracellular DNA as a stress signal in human cells // Oxid. Med. Cell Longev. - 2013. - P. 649747.Ermakov A.V., Konkova M.S., Kostyuk S.V., Izevskaya V.L., Baranova A., Veiko N.N. Oxidized extracellular DNA as a stress signal in human cells // Oxid. Med. Cell Longev. - 2013. - P. 649747.Fleischhacker M., Schmidt B. Circulating nucleic acids (CNAs) and cancer-a survey // Biochim. Biophys. Acta. - 2007. - Vol. 1775, № 1. - P. 181-232.Fleischhacker M., Schmidt B. Circulating nucleic acids (CNAs) and cancer-a survey // Biochim. Biophys. Acta. - 2007. - Vol. 1775, № 1. - P. 181-232.Glebova K.V., Konorova I.L., Marakhonov A.V., Barskov I.V., Khaspekov L.G., Veiko N.N. Oxidative modification of ecDNA alter its biological action on rat neurons // Journal of Nucleic Acids Investigation. - 2011. - Vol. 2, № 1. - P. 28.Glebova K.V., Konorova I.L., Marakhonov A.V., Barskov I.V., Khaspekov L.G., Veiko N.N. Oxidative modification of ecDNA alter its biological action on rat neurons // Journal of Nucleic Acids Investigation. - 2011. - Vol. 2, № 1. - P. 28.Kawanishi S., Hiraku Y., Oikawa S. Mechanism of guanine-specific DNA damage by oxidative stress and its role in carcinogenesis and aging // Mutat. Res. - 2001. - Vol. 488, № 1. - P. 65-76.Kawanishi S., Hiraku Y., Oikawa S. Mechanism of guanine-specific DNA damage by oxidative stress and its role in carcinogenesis and aging // Mutat. Res. - 2001. - Vol. 488, № 1. - P. 65-76.Kostyuk S., Smirnova T., Kameneva L., Porokhovnik L., Speranskij A., Ershova E., Stukalov S., Izevskaya V., Veiko N. GC-Rich Extracellular DNA Induces Oxidative Stress, Double-Strand DNA Breaks, and DNA Damage Response in Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells // Oxid. Med. Cell Longev. - 2015. - Vol. 2015, Article ID 782123, 15 pages.Kostyuk S., Smirnova T., Kameneva L., Porokhovnik L., Speranskij A., Ershova E., Stukalov S., Izevskaya V., Veiko N. GC-Rich Extracellular DNA Induces Oxidative Stress, Double-Strand DNA Breaks, and DNA Damage Response in Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells // Oxid. Med. Cell Longev. - 2015. - Vol. 2015, Article ID 782123, 15 pages.Ploskonosova I.I., Baranov V.I., Gaziev A.I. PCR assay of DNA damage and repair at the gene level in brain and spleen of gamma-irradiated young and old rats // Mutat. Res. - 1999. - Vol. 434, № 2. - P. 109-127.Ploskonosova I.I., Baranov V.I., Gaziev A.I. PCR assay of DNA damage and repair at the gene level in brain and spleen of gamma-irradiated young and old rats // Mutat. Res. - 1999. - Vol. 434, № 2. - P. 109-127.Speranskii A.I., Kostyuk S.V., Kalashnikova E.A., Veiko N.N. Enrichment of extracellular DNA from the cultivation medium of human peripheral blood mononuclears with Genomic CpG rich fragments results in increased cell production of IL-6 and TNFa via activation of the NF-kB signaling pathway // Biochemistry (Moscow) Supplement Series B Biomedical Chemistry. - 2015. - Vol. 9, № 2. - P. 174-184.Speranskii A.I., Kostyuk S.V., Kalashnikova E.A., Veiko N.N. Enrichment of extracellular DNA from the cultivation medium of human peripheral blood mononuclears with Genomic CpG rich fragments results in increased cell production of IL-6 and TNFa via activation of the NF-kB signaling pathway // Biochemistry (Moscow) Supplement Series B Biomedical Chemistry. - 2015. - Vol. 9, № 2. - P. 174-184.Suter M., Richter C. Fragmented mitochondrial DNA is the predominant carder of oxidized DNA bases // Biochemistry. - 1999. - Vol. 38, № 1. - P. 459-464.Suter M., Richter C. Fragmented mitochondrial DNA is the predominant carder of oxidized DNA bases // Biochemistry. - 1999. - Vol. 38, № 1. - P. 459-464.Zafiropoulos A., Tsentelierou E., Linardakis M., Kafatos A., Spandidos D.A. Preferential loss of 5S and 28S rDNA genes in human adipose tissue during ageing // Int. J. Biochem. Cell Biol. - 2005. - Vol. 37, № 2. - P. 409-415.Zafiropoulos A., Tsentelierou E., Linardakis M., Kafatos A., Spandidos D.A. Preferential loss of 5S and 28S rDNA genes in human adipose tissue during ageing // Int. J. Biochem. Cell Biol. - 2005. - Vol. 37, № 2. - P. 409-415.Zhang F., Gu W., Hurles M.E., Lupski J.R. Copy number variation in human health, disease, and evolution // Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. - 2009. - Vol. 10. - P. 451-481.Zhang F., Gu W., Hurles M.E., Lupski J.R. Copy number variation in human health, disease, and evolution // Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. - 2009. - Vol. 10. - P. 451-481.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.