medgenМедицинская генетикаMedical Genetics2073-7998Publishing House «Genius Media» LLC10.25557/2073-7998.2018.04.42-46medgen-432Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯORIGINAL RESEARCHФункциональное подтверждение патогенности варианта интронной последовательности гена PAX6Evidence of pathogenic role an intronic variant in PAX6 gene using functional analysisФилатоваА. Ю.FilatovaA. Yu.noemail@neicon.ruВасильеваТ. А.VasilyevaT. A.noemail@neicon.ruСкобловМ. Ю.SkoblovM. Yu.noemail@neicon.ruКадышевВ. В.KadyshevV. V.noemail@neicon.ruВоскресенскаяА. А.VoskresenskayaA. A.noemail@neicon.ruМарахоновА. В.MarakhonovA. V.noemail@neicon.ruЗинченкоР. А.ZinchenkoR. A.renazinchenko@mail.ruФГБНУ «Медико-генетический научный центр»РоссияResearch Center for Medical GeneticsRussian FederationФГБНУ «Медико-генетический научный центр»; ФГАОУ ВО «Московский физико-технический институт (государственный университет)»РоссияResearch Center for Medical Genetics; Moscow Institute of Physics and Technology (State University)Russian FederationЧебоксарский филиал ФГАУ «Межотраслевой научно-технический комплекс «Микрохирургия глаза» имени академика С.Н. Федорова»РоссияCheboksary branch of S. Fyodorov Eye Microsurgery Federal State InstitutionRussian FederationФГБНУ «Медико-генетический научный центр»; ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова»РоссияResearch Center for Medical Genetics; Pirogov Russian National Research Medical UniversityRussian Federation2018060620181744246Copyright © Филатова А.Ю., Васильева Т.А., Скоблов М.Ю., Кадышев В.В., Воскресенская А.А., Марахонов А.В., Зинченко Р.А., 20182018Филатова А.Ю., Васильева Т.А., Скоблов М.Ю., Кадышев В.В., Воскресенская А.А., Марахонов А.В., Зинченко Р.А.Filatova A.Y., Vasilyeva T.A., Skoblov M.Y., Kadyshev V.V., Voskresenskaya A.A., Marakhonov A.V., Zinchenko R.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.medgen-journal.ru/jour/article/view/432

Врожденная аниридия (OMIM #106210) (ВА) - моногенный врожденный порок развития с аутосомно-доминантным типом наследования, встречающийся в популяции с частотой 1:45 000-1:100 000 населения. Ведущими диагностическими признаками являются врожденное отсутствие ткани радужки, гипоплазия центральной ямки и нистагм. Подавляющее большинство случаев ВА обусловлено гетерозиготными мутациями в гене PAX6 , расположенном в регионе 11р13, а также хромосомными перестройками, затрагивающими этот регион. Ранее в лаборатории генетической эпидемиологии проведен молекулярно-генетический анализ в группе из 110 больных из 84 неродственных семей с клиническим диагнозом врожденной аниридия из России, включавший секвенирование и анализ вариации числа копий генов в регионе 11р13. В общей сложности найден 81 вариант нуклеотидной последовательности, значительную часть которых (13,6%) составляют интронные мутации, локализующиеся как в канонических сайтах сплайсинга, так и глубоко в интронных областях (11 различных мутаций у 18 больных). Данные варианты нуклеотидной последовательности были проанализированы с использованием программ HSF v. 3.0 (Human Splicing Finder) и IntSplice. Их патогенный статус, как и других обнаруженных мутаций, устанавливался в соответствии с рекомендациями ACMG для интерпретации вариантов последовательностей ДНК. Настоящая работа посвящена доказательству влияния выявленного в спорадическом случае врожденной аниридии интронного варианта нуклеотидной последовательности с неизвестным клиническим значением NG_008679.1( PAX6 _v001):c.142-14C>G на паттерн сплайсинга. Функциональный анализ с использованием системы экспрессии минигенов in vitro показал, что данная замена ведет к возникновению нового акцепторного сайта сплайсинга интрона 5, в результате чего происходит удлинение экзона 6 на 13 нуклеотидов и сдвиг открытой рамки считывания (NM_000280.4( PAX6 _v001):c.141_142insTTCCCCTATGCAG, p.Val48PhefsTer12) с разрушением аберрантной мРНК по нонсенс-опосредованному механизму деградации (NMD). Таким образом, исследуемая интронная замена продуцирует нулевой аллель и ведет к гаплонедостаточности функции гена PAX6 , что приводит к развитию заболевания.

Congenital aniridia (OMIM #106210) (ВА) is a Mendelian autosomal dominant panocular disorder with complete penetrance and variable expressivity. The incidence of aniridia is 1 in 45,000-100,000 births. Aniridia is characterized by congenital absence of the iris with foveal hypoplasia and other eye abnormalities. The most cases of aniridia is caused by heterozygous mutations in the PAX6 gene or chromosome 11p13 rearrangements. Molecular analysis (including Sanger sequencing as well as MLPA analysis and the loss of heterozygosity analysis) of 110 patients referred with congenital aniridia from 84 unrelated families identifies causative PAX6 mutations in all except 3 patients (81/84). A significant proportion of point PAX6 mutations affecting canonical splicing sites and deeper intronic sequences (13,6%) (11 different mutations in 18 patients) have been revealed. Intron sequence variants pathogenic status is established in accordance with ACMG recommendations for interpretation of sequence variants. The manuscript gives consideration to the functional evidence of a revealed in patient with congenital aniridia VUS (variant of unknown clinical significance) NG_008679.1(PAX6_v001):c.142-14C>G effect on the splicing pattern. We used a minigene system to determine the effect of investigated mutation in vitro in human cell line HEK293. Our analysis has shown that this single nucleotide substitution leads to a splicing disruption due to the use of the new acceptor-site of intron 5. That leads to exon 6 elongation by 13 nucleotides, open reading frame shifting (NM_000280.4(PAX6_v001):c.141_142insTTCCCCTATGCAG, p.Val48PhefsTer12) and aberrant mRNA degradation by NMD (nonsense-mediated mRNA decay) mechanism. Thus, the intron sequence variant produces a null allele, leading to a haploinsufficiency of the PAX6 -function and the development of disease.

врожденная аниридиягаплонедостаточностьPAX6мутацииприводящие к нарушению сплайсингафункциональный анализклонированиесистема экспрессии минигенов in vitroОТ-ПЦРHEK293congenital aniridiaPAX6haploinsufficiencysplicing mutationsvariant of unknown clinical significancefunctional evidencecloningin vitro mini-gene expression systemRT-PCRHEK293ReferencesВасильева Т.А., Воскресенская А.А., Хлебникова О.В. и др. Дифференциальная диагностика наследственных форм врожденной аниридии с позиций современной генетики // Вестник РАМН. 2017. Т. 72. № 4. С. 233-241. doi: 10.15690/vramn834Васильева Т.А., Воскресенская А.А., Хлебникова О.В. и др. Дифференциальная диагностика наследственных форм врожденной аниридии с позиций современной генетики // Вестник РАМН. 2017. Т. 72. № 4. С. 233-241. doi: 10.15690/vramn834Hingorani M., Hanson I., van Heyningen V. Aniridia // Eur J Hum Genet. 2012. V. 20. № 10. P. 1011-7. doi: 10.1038/ejhg.2012.100Hingorani M., Hanson I., van Heyningen V. Aniridia // Eur J Hum Genet. 2012. V. 20. № 10. P. 1011-7. doi: 10.1038/ejhg.2012.100Васильева Т.А., Хлебникова О.В., Марахонов А.В. и др. Изучение генетических основ и разработка протоколов для диагностики наследственных заболеваний органа зрения на примере врожденной аниридии // Медицинская генетика. 2016. Т. 15. № 6. С. 37-43.Васильева Т.А., Хлебникова О.В., Марахонов А.В. и др. Изучение генетических основ и разработка протоколов для диагностики наследственных заболеваний органа зрения на примере врожденной аниридии // Медицинская генетика. 2016. Т. 15. № 6. С. 37-43.Vasilyeva T.A., Voskresenskaya A.A., Kаsmann-Kellner B. et al. Molecular analysis of patients with aniridia in Russian Federation broadens the spectrum of PAX6 mutations // Clin Genet. 2017. V. 92. № 6. P. 639-644. doi: 10.1111/cge.13019Vasilyeva T.A., Voskresenskaya A.A., Kаsmann-Kellner B. et al. Molecular analysis of patients with aniridia in Russian Federation broadens the spectrum of PAX6 mutations // Clin Genet. 2017. V. 92. № 6. P. 639-644. doi: 10.1111/cge.13019Richards S., Aziz N., Bale S. et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology // Genet Med. 2015. V. 17. № 5. P. 405-24. doi: 10.1038/gim.2015.30Richards S., Aziz N., Bale S. et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology // Genet Med. 2015. V. 17. № 5. P. 405-24. doi: 10.1038/gim.2015.30Марахонов А.В., Васильева Т.А., Воскресенская А.А. и др. Опыт применения медицинской технологии диагностики врожденной аниридии в ФГБНУ «МГНЦ» // Медицинская генетика. 2017. Т. 16. № 11. С. 23-26.Марахонов А.В., Васильева Т.А., Воскресенская А.А. и др. Опыт применения медицинской технологии диагностики врожденной аниридии в ФГБНУ «МГНЦ» // Медицинская генетика. 2017. Т. 16. № 11. С. 23-26.Desmet F.O., Hamroun D., Lalande M. et al. Human Splicing Finder: an online bioinformatics tool to predict splicing signals // Nucleic Acids Res. 2009. V. 37. № 9. P. e67. doi: 10.1093/nar/gkp215Desmet F.O., Hamroun D., Lalande M. et al. Human Splicing Finder: an online bioinformatics tool to predict splicing signals // Nucleic Acids Res. 2009. V. 37. № 9. P. e67. doi: 10.1093/nar/gkp215Shibata A., Okuno T., Rahman M.A. et al. IntSplice: prediction of the splicing consequences of intronic single-nucleotide variations in the human genome // J Hum Genet. 2016. V. 61. № 7. P. 633-40. doi: 10.1038/jhg.2016.23Shibata A., Okuno T., Rahman M.A. et al. IntSplice: prediction of the splicing consequences of intronic single-nucleotide variations in the human genome // J Hum Genet. 2016. V. 61. № 7. P. 633-40. doi: 10.1038/jhg.2016.23Gurskaya N.G., Staroverov D.B., Zhang L. et al. Analysis of alternative splicing of cassette exons at single-cell level using two fluorescent proteins // Nucleic Acids Res. 2012. V. 40. № 8. P. e57. doi: 10.1093/nar/gkr1314Gurskaya N.G., Staroverov D.B., Zhang L. et al. Analysis of alternative splicing of cassette exons at single-cell level using two fluorescent proteins // Nucleic Acids Res. 2012. V. 40. № 8. P. e57. doi: 10.1093/nar/gkr1314Sperling R. The nuts and bolts of the endogenous spliceosome // Wiley Interdiscip Rev RNA. 2017. V. 8. № 1 doi: 10.1002/wrna.1377Sperling R. The nuts and bolts of the endogenous spliceosome // Wiley Interdiscip Rev RNA. 2017. V. 8. № 1 doi: 10.1002/wrna.1377Liu S.R., Hu C.G., Zhang J.Z. Regulatory effects of cotranscriptional RNA structure formation and transitions // Wiley Interdiscip Rev RNA. 2016. V. 7. № 5. P. 562-74. doi: 10.1002/wrna.1350Liu S.R., Hu C.G., Zhang J.Z. Regulatory effects of cotranscriptional RNA structure formation and transitions // Wiley Interdiscip Rev RNA. 2016. V. 7. № 5. P. 562-74. doi: 10.1002/wrna.1350Weisschuh N., Wissinger B., Gramer E. A splice site mutation in the PAX6 gene which induces exon skipping causes autosomal dominant inherited aniridia // Mol Vis. 2012. V. 18. P. 751-7.Weisschuh N., Wissinger B., Gramer E. A splice site mutation in the PAX6 gene which induces exon skipping causes autosomal dominant inherited aniridia // Mol Vis. 2012. V. 18. P. 751-7.Shoemaker C.J., Green R. Translation drives mRNA quality control // Nat Struct Mol Biol. 2012. V. 19. № 6. P. 594-601. doi: 10.1038/nsmb.2301Shoemaker C.J., Green R. Translation drives mRNA quality control // Nat Struct Mol Biol. 2012. V. 19. № 6. P. 594-601. doi: 10.1038/nsmb.2301Denisov S.V., Bazykin G.A., Sutormin R. et al. Weak negative and positive selection and the drift load at splice sites // Genome Biol Evol. 2014. V. 6. № 6. P. 1437-47. doi: 10.1093/gbe/evu100Denisov S.V., Bazykin G.A., Sutormin R. et al. Weak negative and positive selection and the drift load at splice sites // Genome Biol Evol. 2014. V. 6. № 6. P. 1437-47. doi: 10.1093/gbe/evu100

The authors declare that there are no conflicts of interest present.