medgenМедицинская генетикаMedical Genetics2073-7998Publishing House «Genius Media» LLCmedgen-334Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯORIGINAL RESEARCHМедицинская ДНК-технология оценки чувствительности опухолей молочной железы люминального В подтипа к неоадъювантной химиотерапии с применением антрациклинов на основе маркеров метилирования ДНКMedical DNA technology for evaluating the sensitivity of luminal B breast tumors to neoadjuvant anthracycline chemotherapy based on DNA methylation markersСигинВ. О.SiginV. O.sigin.vladimir@gmail.comКузнецоваЕ. Б.KuznetsovaE. B.noemail@neicon.ruСимоноваО. А.SimonovaO. A.noemail@neicon.ruЖевловаА. И.ZhevlovaA. I.noemail@neicon.ruЛитвяковН. В.LitviakovN. V.noemail@neicon.ruСлонимскаяЕ. М.SlonimskayaE. M.noemail@neicon.ruЦыгановМ. М.TsyganovM. M.noemail@neicon.ruВолодинИ. В.VolodinI. V.noemail@neicon.ruШикееваА. А.ShikeevaA. A.noemail@neicon.ruСтрельниковВ. В.StrelnikovV. V.noemail@neicon.ruЗалетаевД. В.ZaletaevD. V.noemail@neicon.ruТанасА. С.TanasA. S.noemail@neicon.ru«Медико-генетический научный центр»; Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова Министерства здравоохранения Российской ФедерацииРоссияResearch Centre for Medical Genetics; Pirogov Russian National Research Medical UniversityRussian Federation«Медико-генетический научный центр»; Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской ФедерацииРоссияResearch Centre for Medical Genetics; I.M. Sechenov First Moscow State Medical UniversityRussian Federation«Медико-генетический научный центр»РоссияResearch Centre for Medical GeneticsRussian FederationНаучно-исследовательский институт онкологии Томского национального исследовательского медицинского центра Российской академии наук; Национальный исследовательский Томский государственный университетРоссияTomsk Cancer Research Institute; National Research Tomsk State UniversityRussian FederationНаучно-исследовательский институт онкологии Томского национального исследовательского медицинского центра Российской академии наукРоссияTomsk Cancer Research InstituteRussian Federation20172002201816102935Copyright © Сигин В.О., Кузнецова Е.Б., Симонова О.А., Жевлова А.И., Литвяков Н.В., Слонимская Е.М., Цыганов М.М., Володин И.В., Шикеева А.А., Стрельников В.В., Залетаев Д.В., Танас А.С., 20182018Сигин В.О., Кузнецова Е.Б., Симонова О.А., Жевлова А.И., Литвяков Н.В., Слонимская Е.М., Цыганов М.М., Володин И.В., Шикеева А.А., Стрельников В.В., Залетаев Д.В., Танас А.С.Sigin V.O., Kuznetsova E.B., Simonova O.A., Zhevlova A.I., Litviakov N.V., Slonimskaya E.M., Tsyganov M.M., Volodin I.V., Shikeeva A.A., Strelnikov V.V., Zaletaev D.V., Tanas A.S.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.medgen-journal.ru/jour/article/view/334

Цель. Разработать ДНК-технологию прогноза эффективности неоадъювантной химиотерапии (НАХТ) рака молочной железы (РМЖ) на основе определения состояния метилирования ограниченного набора маркеров метилирования ДНК методом многолокусной метилчувствительной полимеразной цепной реакции (МЧ-ПЦР). Задачи. (1) Провести широкогеномный анализ метилирования ДНК из биоптатов опухолей молочной железы до проведения НАХТ с применением антрациклинов. (2) Сформировать ограниченную панель маркеров метилирования ДНК, наиболее информативных с точки зрения прогноза эффективности НАХТ. (3) Разработать и оптимизировать лабораторный протокол многолокусной МЧ-ПЦР для определения статуса метилирования маркеров разработанной панели. (4) Оценить диагностические свойства полученной панели маркеров метилирования ДНК. Материалы и методы. Методом XmaI-RRBS проведён широкогеномный анализ 27 биопсийных образцов РМЖ люминального B подтипа, взятых до лечения под контролем УЗИ. По результатам XmaI-RRBS выбраны 10 генов, состояние метилирования промоторов которых наиболее эффективно маркирует эпигенетические подтипы опухолей с разным ответом на НАХТ. Состояние метилирования выбранных маркеров определяли методом МЧ-ПЦР с тремя пулами праймеров в выборке из 40 образцов ДНК биопсийных образцов РМЖ люминального B подтипа, взятых до лечения. Оценку диагностических свойств системы проводили методом ROC-анализа. Результаты. По данным широкогеномного анализа метилирования ДНК в качестве наиболее информативных маркеров чувствительности РМЖ к НАХТ с использованием антрациклинов определили участки генов SLC9A3, C1QL2, DPYS, IRF4, ADCY8, KCNQ2, TERT, SYNDIG1, SKOR2 и GRIK1 . Для проведения локус-специфического тестирования состояния метилирования этих маркеров разработали систему многолокусной МЧ-ПЦР. По результатам локус-специфического тестирования определили диагностические свойства системы: площадь под ROC-кривой составила 84%, чувствительность системы - 82% при специфичности 80%, точность - 82%. Выводы. Система, включающая ограниченное количество маркеров метилирования ДНК, позволяет эффективно прогнозировать ответ опухоли молочной железы люминального В подтипа на НАХТ с использованием антрациклинов по результатам анализа биопсийного материала, полученного до начала лечения.

Objective. To develop a DNA technology for the prognosis of the effectiveness of neoadjuvant chemotherapy of breast cancer (BC) based on the determination of the methylation state of a limited set of DNA methylation markers by the method of multilocus methylation sensitive restriction enzyme polymerase chain reaction (MSRE-PCR). Material and methods. The research workflow was as follows. (1) Carry out a genome wide DNA methylation analysis on biopsy samples of breast tumors prior to anthracycline neoadjuvant chemotherapy. (2) Develop a limited panel of DNA methylation markers, the most informative for the prognosis of the effectiveness of neoadjuvant chemotherapy. (3) Develop and optimize the laboratory protocol of multi-locus MSRE-PCR for determining the methylation status of the markers in the panel. (4) Evaluate the diagnostic properties of the resulting panel of DNA methylation markers. Genome wide DNA methylation analysis of 27 BC biopsy specimens of the luminal B subtype, taken before the treatment under ultrasound guidance, was performed using the XmaI-RRBS method. According to the results of XmaI-RRBS, 10 genes have been selected, the state of methylation of the promoters of which most effectively marks epigenetic subtypes of tumors with different responses to neoadjuvant chemotherapy. Methylation status of the selected markers was next determined by MSRE-PCR with three primer pools in a sample of 40 BC biopsy specimens of the luminal B subtype taken before the treatment. Evaluation of the diagnostic properties of the system was carried out by ROC analysis. Results. By the genome wide DNA methylation analysis, the SLC9A3 , C1QL2 , DPYS , IRF4 , ADCY8 , KCNQ2 , TERT , SYNDIG1 , SKOR2 and GRIK1 gene regions were identified as the most informative markers of BC sensitivity to anthracycline neoadjuvant chemotherapy. To conduct locus-specific testing of the methylation status of these markers we have developed a multi-locus MSRE-PCR system. Based on the results of the locus-specific testing, the diagnostic properties of the system were determined: the area under the ROC curve was 84%, the sensitivity of the system was 82% with the specificity of 80%, the accuracy was 82%. Conclusion. The system including a limited number of DNA methylation markers, makes it possible to effectively predict the response of a luminal B subtype breast tumors to anthracycline neoadjuvant chemotherapy by an analysis of biopsy material obtained prior to treatment.

рак молочной железынеоадъювантная химиотерапияширокогеномный анализ метилирования ДНКмноголокусная метилчувствительная ПЦРBreast cancerneoadjuvant chemotherapygenome wide analysis of DNA methylationmultilocus methylation sensitive restriction enzyme PCRReferencesKaufmann M., von Minckwitz G., Mamounas E.P., et al. Recommendations from an international consensus conference on the current status and future of neoadjuvant systemic therapy in primary breast cancer. Ann Surg Oncol. 2012; 19(5): 1508-1516.Kaufmann M., von Minckwitz G., Mamounas E.P., et al. Recommendations from an international consensus conference on the current status and future of neoadjuvant systemic therapy in primary breast cancer. Ann Surg Oncol. 2012; 19(5): 1508-1516.Litviakov N.V., Cherdyntseva N.V., Tsyganov M.M., Slonimskaya Е.M., Ibragimova M.K., Kazantseva P.V., Kzhyshkowska Julia, Choinzonov E.L. Deletions of multidrug resistance gene loci in breast cancer leads to the down-regulation of its expression and predict tumor response to neoadjuvant chemotherapy. Oncotarget. 2016; 7(7): 7829-7841.Litviakov N.V., Cherdyntseva N.V., Tsyganov M.M., Slonimskaya Е.M., Ibragimova M.K., Kazantseva P.V., Kzhyshkowska Julia, Choinzonov E.L. Deletions of multidrug resistance gene loci in breast cancer leads to the down-regulation of its expression and predict tumor response to neoadjuvant chemotherapy. Oncotarget. 2016; 7(7): 7829-7841.Казанцева П.В., Цыганов М.М., Слонимская Е.М., Литвяков Н.В., Чердынцева Н.В., Ибрагимова М.К., Дорошенко А.В., Тарабановская Н.А., Паталяк С.В. Молекулярно-генетические маркеры эффективности неоадъювантной химиотерапии с применением антрациклинов у больных раком молочной железы. Сибирский онкологический журнал. 2016; 15(2): 29-35.Казанцева П.В., Цыганов М.М., Слонимская Е.М., Литвяков Н.В., Чердынцева Н.В., Ибрагимова М.К., Дорошенко А.В., Тарабановская Н.А., Паталяк С.В. Молекулярно-генетические маркеры эффективности неоадъювантной химиотерапии с применением антрациклинов у больных раком молочной железы. Сибирский онкологический журнал. 2016; 15(2): 29-35.М.М. Цыганов, А.Г. Щербакова Метилирование промоторов генов множественной лекарственной устойчивости в опухолевой ткани молочной железы и эффект неоадъювантной химиотерапии. Сибирский онкологический журнал. 2012; 172-173М.М. Цыганов, А.Г. Щербакова Метилирование промоторов генов множественной лекарственной устойчивости в опухолевой ткани молочной железы и эффект неоадъювантной химиотерапии. Сибирский онкологический журнал. 2012; 172-173Стрельников В.В. Основные направления молекулярно-генетических исследований в онкологии // Медицинская генетика. - 2012. - №10Стрельников В.В. Основные направления молекулярно-генетических исследований в онкологии // Медицинская генетика. - 2012. - №10Aubele M. et al. The Predictive Value of PITX2 DNA Methylation for High-Risk Breast Cancer Therapy: Current Guidelines, Medical Needs, and Challenges //Disease Markers. - 2017. - Т. 2017.Aubele M. et al. The Predictive Value of PITX2 DNA Methylation for High-Risk Breast Cancer Therapy: Current Guidelines, Medical Needs, and Challenges //Disease Markers. - 2017. - Т. 2017.Akiyama Y. et al. GATA-4 and GATA-5 transcription factor genes and potential downstream antitumor target genes are epigenetically silenced in colorectal and gastric cancer //Molecular and cellular biology. - 2003. - Т. 23. - №. 23. - С. 8429-8439.Akiyama Y. et al. GATA-4 and GATA-5 transcription factor genes and potential downstream antitumor target genes are epigenetically silenced in colorectal and gastric cancer //Molecular and cellular biology. - 2003. - Т. 23. - №. 23. - С. 8429-8439.Cancer Genome Atlas Network Et al. Comprehensive molecular portraits of human breast tumors. Nature. 2012; 490(7418): 61-70Cancer Genome Atlas Network Et al. Comprehensive molecular portraits of human breast tumors. Nature. 2012; 490(7418): 61-70Tanas A.S., Borisova M.E., Kuznetsova E.B., Rudenko V.V., Karandasheva K.O., Nemtsova M.V., Izhevskaya V.L., Simonova O.A., Larin S.S., Zaletaev D.V., Strelnikov V.V. Rapid and Affordable Genome-Wide Bisulfite DNA Sequencing by XmaI-reduced Representation Bisulfite Sequencing. Epigenomics. 2017; 9(6): 833-847.Tanas A.S., Borisova M.E., Kuznetsova E.B., Rudenko V.V., Karandasheva K.O., Nemtsova M.V., Izhevskaya V.L., Simonova O.A., Larin S.S., Zaletaev D.V., Strelnikov V.V. Rapid and Affordable Genome-Wide Bisulfite DNA Sequencing by XmaI-reduced Representation Bisulfite Sequencing. Epigenomics. 2017; 9(6): 833-847.Стрельников В.В., Танас А.С., Руденко В.В., Кузнецова Е.Б., Залетаев Д.В. Геномный анализ метилирования ДНК с использованием секвенирования нового поколения. Медицинская генетика. 2014; 13(3): 32-37.Стрельников В.В., Танас А.С., Руденко В.В., Кузнецова Е.Б., Залетаев Д.В. Геномный анализ метилирования ДНК с использованием секвенирования нового поколения. Медицинская генетика. 2014; 13(3): 32-37.Танас А.С., Кузнецова Е.Б., Борисова М.Э., Руденко В.В., Залетаев Д.В., Стрельников В.В. Дизайн метода бисульфитного секвенирования ограниченных наборов геномных локусов (RRBS) для анализа метилирования CpG-островков человека в больших выборках. Молекулярная биология. 2015; 49(4): 689-699.Танас А.С., Кузнецова Е.Б., Борисова М.Э., Руденко В.В., Залетаев Д.В., Стрельников В.В. Дизайн метода бисульфитного секвенирования ограниченных наборов геномных локусов (RRBS) для анализа метилирования CpG-островков человека в больших выборках. Молекулярная биология. 2015; 49(4): 689-699.Raizis A. M., Schmitt F., Jost J. P. A bisulfite method of 5-methylcytosine mapping that minimizes template degradation. Analytical biochemistry. 1995; 226(1): 161-166.Raizis A. M., Schmitt F., Jost J. P. A bisulfite method of 5-methylcytosine mapping that minimizes template degradation. Analytical biochemistry. 1995; 226(1): 161-166.Olova N., Krueger F., Andrews S., Oxley D.O., Branco M.R., Reik W. Comparison of whole-genome bisulfite sequencing library preparation strategies identifies sources of biases affecting DNA methylation data. bioRxiv. 2017: 165449.Olova N., Krueger F., Andrews S., Oxley D.O., Branco M.R., Reik W. Comparison of whole-genome bisulfite sequencing library preparation strategies identifies sources of biases affecting DNA methylation data. bioRxiv. 2017: 165449.Melnikov A.A., Gartenhaus R.B., Levenson A.S., Motchoulskaia N.A., Levenson V.V. MSRE-PCR for analysis of gene-specific DNA methylation. Nucleic acids research. 2005; 33(10): e93.Melnikov A.A., Gartenhaus R.B., Levenson A.S., Motchoulskaia N.A., Levenson V.V. MSRE-PCR for analysis of gene-specific DNA methylation. Nucleic acids research. 2005; 33(10): e93.Стрельников В.В., Танас А.С., Кузнецова Е.Б. Методология локус-специфического анализа метилирования ДНК. Издательство: LAP Lambert Academic Publishing. ISBN 9783659670411; 2014; 104 С.Стрельников В.В., Танас А.С., Кузнецова Е.Б. Методология локус-специфического анализа метилирования ДНК. Издательство: LAP Lambert Academic Publishing. ISBN 9783659670411; 2014; 104 С.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.