medgenМедицинская генетикаMedical Genetics2073-7998Publishing House «Genius Media» LLC10.25557/2073-7998.2024.11.34-39medgen-2571Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯORIGINAL RESEARCHСоздание собственных несерийных ДНК-зондов для выявления рекуррентной анеуплоидии по хромосоме 12 в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках человека методом FISHDetection of recurrent chromosome 12 aneuploidy in human induced pluripotent stem cells using FISH with custom centromeric DNA-probesГумероваЛ. И.GumerovaL. И.

115522, г. Москва, ул. Москворечье, д. 1

1, Moskvorechye st., Moscow, 115522

ЖеглоД. Г.ZhegloD. Г.

115522, г. Москва, ул. Москворечье, д. 1

1, Moskvorechye st., Moscow, 115522

ПожитноваВ. О.PozhitnovaV. O.

115522, г. Москва, ул. Москворечье, д. 1

1, Moskvorechye st., Moscow, 115522

СвиридовФ. С.SviridovP. S.

115522, г. Москва, ул. Москворечье, д. 1

1, Moskvorechye st., Moscow, 115522

КисловаА. В.KislovaA. V.

115522, г. Москва, ул. Москворечье, д. 1

1, Moskvorechye st., Moscow, 115522

СвиридоваВ. В.SviridovaV. V.

115522, г. Москва, ул. Москворечье, д. 1

1, Moskvorechye st., Moscow, 115522

КиселевД. С.KiselevD. S.

115522, г. Москва, ул. Москворечье, д. 1

1, Moskvorechye st., Moscow, 115522

МингалёваН. С.MingalevaN. С.

141700, Московская область, г. Долгопрудный, Институтский переулок, д. 9;

125315, г. Москва, ул. Балтийская, д. 8

9, Institutsky lane, Dolgoprudny, Моscow region,141700;

8, Baltiyskaya st., Moscow, 125315

АлсаллумА.AlsalloumA.

141700, Московская область, г. Долгопрудный, Институтский переулок, д. 9;

125315, г. Москва, ул. Балтийская, д. 8

9, Institutsky lane, Dolgoprudny, Моscow region,141700;

8, Baltiyskaya st., Moscow, 125315

ГорностальЕ. А.GornostalE. А.

141700, Московская область, г. Долгопрудный, Институтский переулок, д. 9;

125315, г. Москва, ул. Балтийская, д. 8

9, Institutsky lane, Dolgoprudny, Моscow region,141700;

8, Baltiyskaya st., Moscow, 125315

ВоронинаЕ. С.VoroninaE. S.

 Воронина Е.С.

115522, г. Москва, ул. Москворечье, д. 1

1, Moskvorechye st., Moscow, 115522

vekats@inbox.ruФГБНУ Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. БочковаРоссияResearch Centre for Medical GeneticsRussian FederationМосковский физико-технический институт; Федеральный исследовательский центр оригинальных и перспективных биомедицинских и фармацевтических технологийРоссияMoscow Institute of Physics and Technology; Federal Research Center for Innovator and Emerging Biomedical and Pharmaceutical TechnologiesRussian Federation20240501202523113439Copyright © Гумерова Л.И., Жегло Д.Г., Пожитнова В.О., Свиридов Ф.С., Кислова А.В., Свиридова В.В., Киселев Д.С., Мингалёва Н.С., Алсаллум А., Горносталь Е.А., Воронина Е.С., 20252025Гумерова Л.И., Жегло Д.Г., Пожитнова В.О., Свиридов Ф.С., Кислова А.В., Свиридова В.В., Киселев Д.С., Мингалёва Н.С., Алсаллум А., Горносталь Е.А., Воронина Е.С.Gumerova L.И., Zheglo D.Г., Pozhitnova V.O., Sviridov P.S., Kislova A.V., Sviridova V.V., Kiselev D.S., Mingaleva N.С., Alsalloum A., Gornostal E.А., Voronina E.S.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.medgen-journal.ru/jour/article/view/2571Введение

Введение. Спонтанные хромосомные аберрации в линиях индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК) обнаруживаются с частотой около 20%, что препятствует их дальнейшему использованию в исследовательских и медицинских целях. Одним из наиболее рациональных подходов к рутинному контролю генетической стабильности иПСК является таргетное выявление рекуррентных аномалий кариотипа, 20-60% которых может составлять трисомия по хромосоме 12. Трисомия 12 приводит к нарушению способности к дифференцировке, динамики репликации и сопровождается быстрым вытеснением эуплоидного клона.

Цель

Цель. Разработка протокола получения флуоресцентных ДНК-зондов, специфичных к перицентромерным повторам хромосомы 12, для выявления анеуплоидии методом FISH.

Результаты

Результаты. Разработан двухстадийный протокол получения ДНК-зондов на основе ПЦР с геномной ДНК в качестве матрицы с последующим клик-химическим прямым мечением флуорохромом. На линиях иПСК с известными эуплоидным и анеуплоидным кариотипами отработаны условия гибридизации и подтверждена эффективность и специфичность выявления хромосомы 12 на метафазных пластинках и в интерфазных ядрах.

Выводы

Выводы. FISH с собственными несерийными ДНК-зондами повышает доступность исследования копийности хромосомы 12 в иПСК, что способствует своевременному выявлению функционально значимых генетических нарушений в клеточных линиях.

Background

Background. Approximately 20% of induced pluripotent stem cell (iPSC) lines spontaneously acquire chromosomal abnormalities, which hinders their use in research and medical applications. One rational approach for routine monitoring of genetic stability in iPSCs is the targeted detection of recurrent karyotype anomalies, 20-60% of which may involve trisomy of chromosome 12. Trisomy 12 leads to impaired differentiation capacity and replication dynamics and is associated with the rapid displacement of the euploid clone.

Aim

Aim. To develop a protocol for the production of fluorescent DNA probes for the detection of chromosome 12 aneuploidy.

Results

Results. A two-stage protocol for obtaining DNA probes based on PCR, using genomic DNA as the template, has been developed, followed by direct click-labeling with a fluorochrome. Hybridization conditions have been optimized for iPSC lines with known euploid and aneuploid karyotypes, confirming the effectiveness and specificity of detecting chromosome 12 on metaphase spreads and in     interphase nuclei.

Conclusions

Conclusions. FISH using custom DNA probes enhances the availability of chromosome 12 copy number analysis in laboratories, facilitating the timely detection of functionally significant genetic abnormalities in cell lines.

FISHиндуцированные плюрипотентные стволовые клеткииПСКхромосома 12центромераанеуплоидияFISHinduced pluripotent stem cellsIPSCchromosome 12centromereaneuploidyРабота выполнена в рамках государственного задания Минобрнауки России для ФГБНУ МГНЦ.ReferencesDeng C., Ya A., Compton D.A., Godek K.M. A pluripotent developmental state confers a low fidelity of chromosome segregation. Stem Cell Reports. 2023;18(2):475-488. doi:10.1016/j.stemcr.2022.12.008.Deng C., Ya A., Compton D.A., Godek K.M. A pluripotent developmental state confers a low fidelity of chromosome segregation. Stem Cell Reports. 2023;18(2):475-488. doi:10.1016/j.stemcr.2022.12.008.Milagre I., Pereira C., Oliveira R.A. Compromised Mitotic Fidelity in Human Pluripotent Stem Cells. Int J Mol Sci. 2023 Jul 25;24(15):11933. doi:10.3390/ijms241511933.Milagre I., Pereira C., Oliveira R.A. Compromised Mitotic Fidelity in Human Pluripotent Stem Cells. Int J Mol Sci. 2023 Jul 25;24(15):11933. doi:10.3390/ijms241511933.Al Delbany D., Ghosh M.S., Krivec N., et al. De Novo Cancer Mutations Frequently Associate with Recurrent Chromosomal Abnormalities during Long-Term Human Pluripotent Stem Cell Culture. Cells. 2024;13(16):1395. doi:10.3390/cells13161395.Al Delbany D., Ghosh M.S., Krivec N., et al. De Novo Cancer Mutations Frequently Associate with Recurrent Chromosomal Abnormalities during Long-Term Human Pluripotent Stem Cell Culture. Cells. 2024;13(16):1395. doi:10.3390/cells13161395.Stavish D., Price C.J., Gelezauskaite G., et al. Feeder-free culture of human pluripotent stem cells drives MDM4-mediated gain of chromosome 1q. Stem Cell Reports. 2024;19(8):1217-1232. doi:10.1016/j.stemcr.2024.06.003.Stavish D., Price C.J., Gelezauskaite G., et al. Feeder-free culture of human pluripotent stem cells drives MDM4-mediated gain of chromosome 1q. Stem Cell Reports. 2024;19(8):1217-1232. doi:10.1016/j.stemcr.2024.06.003.DuBose C.O., Daum J.R., Sansam C.L., Gorbsky GJ. Dynamic Features of Chromosomal Instability during Culture of Induced Pluripotent Stem Cells. Genes (Basel). 2022;13(7):1157. doi:10.3390/genes13071157.DuBose C.O., Daum J.R., Sansam C.L., Gorbsky GJ. Dynamic Features of Chromosomal Instability during Culture of Induced Pluripotent Stem Cells. Genes (Basel). 2022;13(7):1157. doi:10.3390/genes13071157.Baker D., Hirst A.J., Gokhale P..J, et al. Detecting Genetic Mosaicism in Cultures of Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 2016;7(5):998-1012. doi:10.1016/j.stemcr.2016.10.003.Baker D., Hirst A.J., Gokhale P..J, et al. Detecting Genetic Mosaicism in Cultures of Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 2016;7(5):998-1012. doi:10.1016/j.stemcr.2016.10.003.Ludwig T.E., Andrews P.W., Barbaric I., et al. ISSCR standards for the use of human stem cells in basic research. Stem Cell Reports. 2023;18(9):1744-1752. doi:10.1016/j.stemcr.2023.08.003.Ludwig T.E., Andrews P.W., Barbaric I., et al. ISSCR standards for the use of human stem cells in basic research. Stem Cell Reports. 2023;18(9):1744-1752. doi:10.1016/j.stemcr.2023.08.003.McIntire E., Taapken S., Leonhard K., Larson A.L. Genomic Stability Testing of Pluripotent Stem Cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 2020 Mar;52(1):e107. doi:10.1002/cpsc.107.McIntire E., Taapken S., Leonhard K., Larson A.L. Genomic Stability Testing of Pluripotent Stem Cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 2020 Mar;52(1):e107. doi:10.1002/cpsc.107.Ben-David U., Arad G., Weissbein U. et al. Aneuploidy induces profound changes in gene expression, proliferation and tumorigenicity of human pluripotent stem cells. Nat Commun. 2014; 5, 4825. Doi:10.1038/ncomms5825.Ben-David U., Arad G., Weissbein U. et al. Aneuploidy induces profound changes in gene expression, proliferation and tumorigenicity of human pluripotent stem cells. Nat Commun. 2014; 5, 4825. Doi:10.1038/ncomms5825.Khademi N.S., Farivar S., Bazrgar M., et al. Aneuploidy Rate and Stemness in Low-Level Mosaic Human Embryonic Stem Cells in the Presence/Absence of Bortezomib, Paclitaxel, and Lapatinib. Cells Tissues Organs. 2024;213(1):17-23. doi:10.1159/000526199.Khademi N.S., Farivar S., Bazrgar M., et al. Aneuploidy Rate and Stemness in Low-Level Mosaic Human Embryonic Stem Cells in the Presence/Absence of Bortezomib, Paclitaxel, and Lapatinib. Cells Tissues Organs. 2024;213(1):17-23. doi:10.1159/000526199.Lamm N., Ben-David U., Golan-Lev T., et al. Genomic Instability in Human Pluripotent Stem Cells Arises from Replicative Stress and Chromosome Condensation Defects. Cell Stem Cell. 2016;18(2):253-61. doi:10.1016/j.stem.2015.11.003.Lamm N., Ben-David U., Golan-Lev T., et al. Genomic Instability in Human Pluripotent Stem Cells Arises from Replicative Stress and Chromosome Condensation Defects. Cell Stem Cell. 2016;18(2):253-61. doi:10.1016/j.stem.2015.11.003.Yanagihara K., Hayashi Y., Liu Y., et al. Trisomy 12 compromises the mesendodermal differentiation propensity of human pluripotent stem cells. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2024;60(5):521-534. doi:10.1007/s11626-023-00824-9.Yanagihara K., Hayashi Y., Liu Y., et al. Trisomy 12 compromises the mesendodermal differentiation propensity of human pluripotent stem cells. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2024;60(5):521-534. doi:10.1007/s11626-023-00824-9.Contreras-Galindo R., Fischer S., Saha A.K. et al. Rapid molecular assays to study human centromere genomics. Genome Res. 2017;27(12):2040-2049. doi:10.1101/gr.219709.116.Contreras-Galindo R., Fischer S., Saha A.K. et al. Rapid molecular assays to study human centromere genomics. Genome Res. 2017;27(12):2040-2049. doi:10.1101/gr.219709.116.Sharma R., Meister P. Generation of Inexpensive, Highly Labeled Probes for Fluorescence In Situ Hybridization (FISH). STAR Protoc. 2020;1(1):100006. doi:10.1016/j.xpro.2019.100006.Sharma R., Meister P. Generation of Inexpensive, Highly Labeled Probes for Fluorescence In Situ Hybridization (FISH). STAR Protoc. 2020;1(1):100006. doi:10.1016/j.xpro.2019.100006.Lengauer C., Dunham I., Featherstone T., Cremer T. Generation of alphoid DNA probes for fluorescence in situ hybridization (FISH) using the polymerase chain reaction. Methods Mol Biol. 1994; 33: 51-61. doi: 10.1385/0-89603-280-9:51. PMID: 7894592.Lengauer C., Dunham I., Featherstone T., Cremer T. Generation of alphoid DNA probes for fluorescence in situ hybridization (FISH) using the polymerase chain reaction. Methods Mol Biol. 1994; 33: 51-61. doi: 10.1385/0-89603-280-9:51. PMID: 7894592.Zhigalina D.I., Skryabin N.A., Vasilieva O.Y. et al. FISH Diagnostics of Chromosomal Translocation with the Technology of Synthesis of Locus-Specific DNA Probes Based on Long-Range PCR. Russ J Genet. 2020; 5 6:739–746. https://doi.org/10.1134/S1022795420060150Zhigalina D.I., Skryabin N.A., Vasilieva O.Y. et al. FISH Diagnostics of Chromosomal Translocation with the Technology of Synthesis of Locus-Specific DNA Probes Based on Long-Range PCR. Russ J Genet. 2020; 5 6:739–746. https://doi.org/10.1134/S1022795420060150Durm M., Haar F.M., Hausmann M., et al. Optimization of fast-fluorescence in situ hybridization with repetitive alpha-satellite probes. Z Naturforsch C J Biosci. 1996;51(3-4):253-61. doi: 10.1515/znc-1996-3-418.Durm M., Haar F.M., Hausmann M., et al. Optimization of fast-fluorescence in situ hybridization with repetitive alpha-satellite probes. Z Naturforsch C J Biosci. 1996;51(3-4):253-61. doi: 10.1515/znc-1996-3-418.Пожитнова В.О., Свиридова В.В., Кислова А.В., и др. Аномалии кариотипа в линиях индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных от российских доноров. Медицинская генетика. 2023;22(12):59-66. https://doi.org/10.25557/2073-7998.2023.12.59-66Пожитнова В.О., Свиридова В.В., Кислова А.В., и др. Аномалии кариотипа в линиях индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных от российских доноров. Медицинская генетика. 2023;22(12):59-66. https://doi.org/10.25557/2073-7998.2023.12.59-66Dekel-Naftali M., Aviram-Goldring A., Litmanovitch T., et al. Screening of human pluripotent stem cells using CGH and FISH reveals low-grade mosaic aneuploidy and a recurrent amplification of chromosome 1q. Eur J Hum Genet. 2012;20(12):1248-55. doi: 10.1038/ejhg.2012.128.Dekel-Naftali M., Aviram-Goldring A., Litmanovitch T., et al. Screening of human pluripotent stem cells using CGH and FISH reveals low-grade mosaic aneuploidy and a recurrent amplification of chromosome 1q. Eur J Hum Genet. 2012;20(12):1248-55. doi: 10.1038/ejhg.2012.128.Peterson S.E., Westra J.W., Rehen S.K., et al. Normal human pluripotent stem cell lines exhibit pervasive mosaic aneuploidy. PLoS One. 2011;6(8):e23018. doi: 10.1371/journal.pone.0023018Peterson S.E., Westra J.W., Rehen S.K., et al. Normal human pluripotent stem cell lines exhibit pervasive mosaic aneuploidy. PLoS One. 2011;6(8):e23018. doi: 10.1371/journal.pone.0023018

The authors declare that there are no conflicts of interest present.