medgenМедицинская генетикаMedical Genetics2073-7998Publishing House «Genius Media» LLC10.25557/2073-7998.2024.10.55-62medgen-2562Research ArticleКРАТКОЕ СООБЩЕНИЕBRIEF REPORTРазработка методики количественной оценки молекул TREC и KREC в цельной крови и сухих пятнах крови методом цифровой ПЦРDevelopment of a method for quantitative assessment of TREC and KREC molecules in whole blood and dried blood spots using digital PCRСлепцовА. А.SleptсovA. A.

634050, г. Томск,  ул. Набережная реки Ушайки, д. 10

10, Naberejnaya Ushaiki, Tomsk, 634050

alexei.sleptcov@medgenetics.ruОрловД. С.OrlovD. S.

634050, г. Томск,  ул. Набережная реки Ушайки, д. 10

10, Naberejnaya Ushaiki, Tomsk, 634050

ОгородниковС. А.OgorodnikovS. A.

634050, г. Томск,  ул. Набережная реки Ушайки, д. 10

10, Naberejnaya Ushaiki, Tomsk, 634050

НазаренкоМ. С.NazarenkoM. S.

634050, г. Томск,  ул. Набережная реки Ушайки, д. 10

634050, г. Томск,  Московский тракт, д. 2

10, Naberejnaya Ushaiki, Tomsk, 634050

2, Moskovsky trakt, Tomsk, 634050

ФГБНУ Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук, Научно-исследовательский институт медицинской генетикиРоссияTomsk National Research Medical Center of the Russian Academy of Sciences, Research Institute of Medical GeneticsRussian FederationФГБНУ Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук, Научно-исследовательский институт медицинской генетики; ФГБОУ ВО Сибирский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской ФедерацииРоссияTomsk National Research Medical Center of the Russian Academy of Sciences, Research Institute of Medical Genetics; Siberian State Medical UniversityRussian Federation20240712202423105562Copyright © Слепцов А.А., Орлов Д.С., Огородников С.А., Назаренко М.С., 20242024Слепцов А.А., Орлов Д.С., Огородников С.А., Назаренко М.С.Sleptсov A.A., Orlov D.S., Ogorodnikov S.A., Nazarenko M.S.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.medgen-journal.ru/jour/article/view/2562

Существует целый ряд патологических состояний, сопровождаемых сниженными показателями Т- и В-лимфоцитов. Оценка этих показателей является жизненно важной для новорожденных, так как без своевременной диагностики и терапии нарушение иммунитета может привести к инфекционным заболеваниям с тяжелым течением, инвалидизации и высокой летальности. Цель исследования заключалась в разработке высокочувствительного и прецизионного метода для подсчета количества наивных Т- и В-лимфоцитов на основе определения эксцизионных кольцевых молекул ДНК TREC и KREC методом цифровой ПЦР. В результате был разработан специфический набор праймеров и проб, позволяющий с высокой точностью определять количество молекул TREC и KREC, а также проводить подсчет количества ядросодержащих клеток. Предложенная методика демонстрирует высокую диагностическую специфичность и чувствительность. Методика может быть применена как скрининговая диагностика иммунодефицитных состояний новорожденных, так и для оценки иммунного статуса у взрослого населения при различных иммунопатологических состояниях.

A reduction in the indices of T- and B-lymphocytes is a common feature of a number of pathological conditions. The assessment of these indices is of paramount importance in the context of newborns, as the absence of timely diagnosis and treatment can result in the development of severe infectious diseases, disability, and high mortality. The objective of this study was to develop a highly sensitive and precise method for enumerating naïve T- and B-lymphocytes based on the quantification of excision circular DNA molecules TREC and KREC through digital polymerase chain reaction. Consequently, a specific set of primers and probes was developed, enabling highly accurate determination of the number of TREC and KREC molecules and counting of the number of nucleated cells. The proposed method exhibits high diagnostic specificity and sensitivity, rendering it suitable for use in both screening diagnostics of immunodeficiency states in newborns and for assessing the immune status in adults with various immunopathological conditions.

неонатальный скринингцифровая ПЦРиммунодефицитные заболеванияneonatal screeningsdigital PCRimmunodeficiency diseasesИсследование выполнено в рамках поисковых научных исследований 123041700028-8 от 17.04.2023 г.The study was carried out according to scientific research 123041700028-8 dated 04/17/2023.Referencesvan Zelm M.C., Szczepanski T., van der Burg M. et al. Replication history of B lymphocytes reveals homeostatic proliferation and extensive antigen-induced B cell expansion. J Exp Med. 2007 Mar 19;204(3):645-655. doi: 10.1084/jem.20060964.van Zelm M.C., Szczepanski T., van der Burg M. et al. Replication history of B lymphocytes reveals homeostatic proliferation and extensive antigen-induced B cell expansion. J Exp Med. 2007 Mar 19;204(3):645-655. doi: 10.1084/jem.20060964.Serana F., Chiarini M., Zanotti C. et al. Use of V(D)J recombination excision circles to identify T- and B-cell defects and to monitor the treatment in primary and acquired immunodeficiencies. J Transl Med. 2013 May 9;11:119. doi: 10.1186/1479-5876-11-119.Serana F., Chiarini M., Zanotti C. et al. Use of V(D)J recombination excision circles to identify T- and B-cell defects and to monitor the treatment in primary and acquired immunodeficiencies. J Transl Med. 2013 May 9;11:119. doi: 10.1186/1479-5876-11-119.King J.R., Hammarström L. Newborn Screening for Primary Immunodeficiency Diseases: History, Current and Future Practice. J Clin Immunol. 2018 Jan;38(1):56-66. doi: 10.1007/s10875-017-0455-x.King J.R., Hammarström L. Newborn Screening for Primary Immunodeficiency Diseases: History, Current and Future Practice. J Clin Immunol. 2018 Jan;38(1):56-66. doi: 10.1007/s10875-017-0455-x.Drylewicz J., Vrisekoop N., Mugwagwa T. et al. Reconciling Longitudinal Naive T-Cell and TREC Dynamics during HIV-1 Infection. PLoS One. 2016 Mar 24;11(3):e0152513. doi: 10.1371/journal.pone.0152513.Drylewicz J., Vrisekoop N., Mugwagwa T. et al. Reconciling Longitudinal Naive T-Cell and TREC Dynamics during HIV-1 Infection. PLoS One. 2016 Mar 24;11(3):e0152513. doi: 10.1371/journal.pone.0152513.Törlén J., Gaballa A., Remberger M. et al. Effect of Graft-versusHost Disease Prophylaxis Regimens on T and B Cell Reconstitution after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 2019 Jun;25(6):1260-1268. doi: 10.1016/j.bbmt.2019.01.029.Törlén J., Gaballa A., Remberger M. et al. Effect of Graft-versusHost Disease Prophylaxis Regimens on T and B Cell Reconstitution after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 2019 Jun;25(6):1260-1268. doi: 10.1016/j.bbmt.2019.01.029.Barbaro M., Ohlsson A., Borte S. et al. Newborn Screening for Severe Primary Immunodeficiency Diseases in Sweden-a 2-Year Pilot TREC and KREC Screening Study. J Clin Immunol. 2017 Jan;37(1):51-60. doi: 10.1007/s10875-016-0347-5.Barbaro M., Ohlsson A., Borte S. et al. Newborn Screening for Severe Primary Immunodeficiency Diseases in Sweden-a 2-Year Pilot TREC and KREC Screening Study. J Clin Immunol. 2017 Jan;37(1):51-60. doi: 10.1007/s10875-016-0347-5.Гордукова М.А., Оскорбин И.П.., Мишукова О.В. и др. Разработка набора реагентов для количественного определения молекул днк trec и krec в цельной крови и сухих пятнах крови методом мультиплексной пцр в режиме реального времени. Медицинская иммунология. 2015;17(5):467-478. doi: 10.15789/1563-0625-2015-5-467-478.Gordukova M.A., Oskorbin I.P., Mishukova O.V., et al. Razrabotka nabora reagentov dlya kolichestvennogo opredeleniya molekul DNK TREC i KREC v tsel’noy krovi i sukhikh pyatnakh krovi metodom mul’tipleksnoy PTSR v rezhime real’nogo vremeni [Development of real-time multiplex PCR for the quantitative determination of TREC’s and KREC’s in whole blood and in dried blood spots]. Meditsinskaya immunologiya [Medical Immunology (Russia)]. 2015;17(5):467-478. (In Russ.) https://doi.org/10.15789/1563-0625-2015-5-467-478Черемохин Д.А., Шинвари Х., Дерябина С.С. и др. Анализ уровней TREС и KREC в образцах сухой крови новорожденных разного гестационного возраста и веса. Acta Naturae. 2022; 14 (1): 101-108. doi: 10.32607/actanaturae.11501.Cheremokhin D.A., Shinwari K., Deryabina S.S., et al. Analiz urovney TREC i KREC v obraztsakh sukhoy krovi novorozhdennykh raznogo gestatsionnogo vozrasta i vesa [Analysis of the TREC and KREC Levels in the Dried Blood Spots of Healthy Newborns with Different Gestational Ages and Weights]. Acta Naturae. 2022;14 (1): 101-108. doi: 10.32607/actanaturae.11501 (In Russ.)Huggett J.F., Cowen S., Foy C.A. Considerations for digital PCR as an accurate molecular diagnostic tool. Clin Chem. 2015 Jan;61(1):79- 88. doi: 10.1373/clinchem.2014.221366.Huggett J.F., Cowen S., Foy C.A. Considerations for digital PCR as an accurate molecular diagnostic tool. Clin Chem. 2015 Jan;61(1):79- 88. doi: 10.1373/clinchem.2014.221366.Hindson B.J., Ness K.D., Masquelier D.A. et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem. 2011 Nov 15;83(22):8604-10. doi: 10.1021/ac202028g.Hindson B.J., Ness K.D., Masquelier D.A. et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem. 2011 Nov 15;83(22):8604-10. doi: 10.1021/ac202028g.Hall E.M., Flores S.R., De Jesús V.R. Influence of Hematocrit and Total-Spot Volume on Performance Characteristics of Dried Blood Spots for Newborn Screening. Int J Neonatal Screen. 2015;1(2):69- 78. doi: 10.3390/ijns1020069.Hall E.M., Flores S.R., De Jesús V.R. Influence of Hematocrit and Total-Spot Volume on Performance Characteristics of Dried Blood Spots for Newborn Screening. Int J Neonatal Screen. 2015;1(2):69- 78. doi: 10.3390/ijns1020069.Слепцов А.А., Медведев С.П., Назаренко М.С.; Томский НИМЦ. Рекомбинантная плазмидная ДНК pGEM-TCRACsjTREC- sjKREC, содержащая нуклеотидныепоследовательности локуса гена Т-лимфоцитарного α-рецептора и сигнальные фрагменты эксцизионных колец Т- и В-клеточного рецепторов. Патент №2807806 РФ. МПК C12Q 1/6809 C12N 15/70. № 2022132020; Заявл.08.12.22; Опубл. 21.11.23., Бюл. № 33.Sleptcov A.A., Medvedev S.P., Nazarenko M.S.; Tomsk National Research Medical Center. Rekombinantnaya plazmidnaya DNK pGEM-TCRAC-sjTREC- sjKREC, soderzhashchaya nukleotidnyye posledovatel’nosti lokusa gena T-limfotsitarnogo a-retseptora i signal’nyye fragmenty ekstsizionnykh kolets T- i V-kletochnogo retseptorov [Recombinant plasmid DNA pGEM-TCRAC-sjTRECsjKREC containing nucleotide sequences of the T-lymphocyte α-receptor gene locus and signal fragments of the excision rings of the T- and B-cell receptors]. Patent No. 2807806 of the Russian Federation. IPC C12Q 1/6809 C12N 15/70. No. 2022132020; Claimed 08.12.22; Published 21.11.23., Bulletin No. 33. (In Russ.)Zakharova I.S., Shevchenko A.I., Tmoyan N.A. et al. Induced pluripotent stem cell line ICGi038-A, obtained by reprogramming peripheral blood mononuclear cells from a patient with familial hyperch o l e s ter o l em i a d u e to com p o u n d h eter o z y g o u s c.1246C>T/c.940+3_940+6del mutations in LDLR. Stem Cell Res. 2022 Apr;60:102702. doi: 10.1016/j.scr.2022.102702.Zakharova I.S., Shevchenko A.I., Tmoyan N.A. et al. Induced pluripotent stem cell line ICGi038-A, obtained by reprogramming peripheral blood mononuclear cells from a patient with familial hyperch o l e s ter o l em i a d u e to com p o u n d h eter o z y g o u s c.1246C>T/c.940+3_940+6del mutations in LDLR. Stem Cell Res. 2022 Apr;60:102702. doi: 10.1016/j.scr.2022.102702.Седых А.В., Сайтгалина М.А., Останкова Ю.В., Тотолян А.А. Сравнительный анализ наборов реагентов для выделения ДНК из сухих пятен крови. Медицинская иммунология. 2023;25(6):1453-1462. doi: 10.15789/1563-0625-CAO-2895.Sedykh A.V., Saitgalina M.A., Ostankova Yu.V., Totolian A.A. Sravnitel’nyy analiz naborov reagentov dlya vydeleniya DNK iz sukhikh pyaten krovi [Comparative analysis of reagent kits for DNA extraction from dry blood stains]. Meditsinskaya immunologiya [Medical Immunology (Russia)]. 2023;25(6):1453-1462. (In Russ.) https://doi.org/10.15789/1563-0625-CAO-2895Vidal-Folch N., Milosevic D., Majumdar R. et al. A Droplet Digital PCR Method for Severe Combined Immunodeficiency Newborn Screening. J Mol Diagn. 2017 Sep;19(5):755-765. doi: 10.1016/j.jmoldx.2017.05.011.Vidal-Folch N., Milosevic D., Majumdar R. et al. A Droplet Digital PCR Method for Severe Combined Immunodeficiency Newborn Screening. J Mol Diagn. 2017 Sep;19(5):755-765. doi: 10.1016/j.jmoldx.2017.05.011

The authors declare that there are no conflicts of interest present.