medgenМедицинская генетикаMedical Genetics2073-7998Publishing House «Genius Media» LLC10.25557/2073-7998.2024.09.49-58medgen-2556Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯORIGINAL RESEARCHМолекулярно-генетическая диагностика мозаичных форм заболеваний с использованием дуплекс-специфической нуклеазы на примере PIK3CA-ассоциированного спектра заболеваний избыточного ростаMolecular genetic diagnosis of mosaic forms using duplex-specific nuclease in patients with PIK3CA-related overgrowth spectrumПустоваловаА. В.PustovalovaA. V.

Пустовалова Анна Васильевна

115522 г. Москва, ул. Москворечье, д. 1

Anna V. Pustovalova

1, Moskvorechye st., Moscow, 115522

a_pustovalova02@inbox.ruНиколаеваА. Ф.NikolaevaA. F.

115522 г. Москва, ул. Москворечье, д. 1

1, Moskvorechye st., Moscow, 115522

ПетроваК. О.PetrovaK. O.

123182 г. Москва, пл. Академика Курчатова, д. 1

1, Akademika Kurchatova square, Moscow, 123182

БычковаЕ. В.BychkovaE. V.

115522 г. Москва, ул. Москворечье, д. 1

1, Moskvorechye st., Moscow, 115522

СигинВ. О.SiginV. O.

115522 г. Москва, ул. Москворечье, д. 1

1, Moskvorechye st., Moscow, 115522

СтрельниковВ. В.StrelnikovV. V.

115522 г. Москва, ул. Москворечье, д. 1

1, Moskvorechye st., Moscow, 115522

ФГБНУ Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. БочковаРоссияResearch Centre for Medical GeneticsRussian FederationФГБУ Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт»РоссияKurchatov InstituteRussian Federation2024051220242394958Copyright © Пустовалова А.В., Николаева А.Ф., Петрова К.О., Бычкова Е.В., Сигин В.О., Стрельников В.В., 20242024Пустовалова А.В., Николаева А.Ф., Петрова К.О., Бычкова Е.В., Сигин В.О., Стрельников В.В.Pustovalova A.V., Nikolaeva A.F., Petrova K.O., Bychkova E.V., Sigin V.O., Strelnikov V.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.medgen-journal.ru/jour/article/view/2556Введение

Введение. Обнаружение интересующих генетических вариантов при мозаичных формах заболеваний может быть существенно осложнено малой представленностью таковых в биологическом материале, взятом для анализа. Существует широкий спектр методологических подходов для выявления редких генетических вариантов в клинико-лабораторной диагностике, однако не все они могут быть доступны для многих лабораторий из-за различных ограничений. Метод с применением дуплекс-специфической нуклеазы (ДСН) с последующим секвенированием по Сэнгеру нацелен на обнаружение низкопредставленных однонуклеотидных генетических вариантов практически в любой точке генома.

Цель

Цель: усовершенствование метода молекулярно-генетической диагностики мозаичных форм генетических заболеваний с применением ДСН на примере PIK3CA-ассоциированного спектра избыточного роста (PROS).

Методы

Методы. Материалом для исследования послужила ДНК из лейкоцитов периферической крови и биоптатов тканей. Для определения аналитических свойств метода моделировали уровень представленности альтернативного аллеля путём добавления в реакционную смесь образцов ДНК, гомозиготных по полиморфному и референсному вариантам, в разном соотношении.

Результаты

Результаты. Минимально достоверно детектируемый уровень представленности альтернативного аллеля составил 1,5%. С использованием метода, основанного на применении ДСН, были подтверждены ранее выявленные на NGS-панели с глубоким покрытием генетические варианты PIK3CA у 9 пациентов с клиническими проявлениями PROS.

Background

Background. The detection of genetic variants of interest in mosaic disease can be significantly complicated by the low representation of such variants in the biological material taken for analysis. There is a wide range of methodological approaches for the detection of rare genetic variants in clinical and laboratory diagnostics, but not all of them may be available to many laboratories due to various limitations. A method using duplex-specific nuclease followed by Sanger sequencing aims to detect low-representation single-nucleotide genetic variants virtually anywhere in the genome.

Aim

Aim: to improve the method of molecular genetic diagnostics of mosaic forms of genetic diseases using duplex-specific nuclease (DSN) on the example of PIK3CA-related overgrowth spectrum (PROS).

Methods

Methods. DNA from peripheral blood leukocytes and tissue biopsies was used as a material for the study. To determine the analytical properties of the method, the level of alternative allele representation was modeled by adding DNA samples homozygous for polymorphic and reference variants to the reaction in different ratios.

Results

Results. The minimum reliably detectable level of alternative allele representation was 1.5%. Using the DSN-based method, the PIK3CA genetic variants previously detected on the NGS panel with high coverage in 9 patients with clinical manifestations of PROS were confirmed.

дуплекс-специфическая нуклеазасеквенирование по СэнгерумозаицизмPROSduplex-specific nucleaseSanger sequencingmosaicismPROSРабота выполнена в рамках государственного задания Минобрнауки России для ФГБНУ МГНЦThe study has been funded by the state assignment of the Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation for RCMG.ReferencesKeppler-Noreuil K.M., Sapp J.C., Lindhurst M.J., et al. Clinical delineation and natural history of the PIK3CA -related overgrowth spectrum. Am J Med Genet A. 2014;164(7):1713–1733. doi: 10.1002/ajmg.a.36552.Keppler-Noreuil K.M., Sapp J.C., Lindhurst M.J., et al. Clinical delineation and natural history of the PIK3CA -related overgrowth spectrum. Am J Med Genet A. 2014;164(7):1713–1733. doi: 10.1002/ajmg.a.36552.Keppler-Noreuil K.M., Rios J.J., Parker V.E.R., et al. PIK3CA -related overgrowth spectrum (PROS): Diagnostic and testing eligibility criteria, differential diagnosis, and evaluation. Am J Med Genet A. 2016;167(2):287–295. doi: 10.1002/ajmg.a.36836.Keppler-Noreuil K.M., Rios J.J., Parker V.E.R., et al. PIK3CA -related overgrowth spectrum (PROS): Diagnostic and testing eligibility criteria, differential diagnosis, and evaluation. Am J Med Genet A. 2016;167(2):287–295. doi: 10.1002/ajmg.a.36836.Nathan N., Keppler-Noreuil K.M., Biesecker L.G., et al. Mosaic Disorders of the PI3K/PTEN/AKT/TSC/mTORC1 Signaling Pathway. Dermatol Clin. 2017;35(1):51-60. doi: 10.1016/j.det.2016.07.001.Nathan N., Keppler-Noreuil K.M., Biesecker L.G., et al. Mosaic Disorders of the PI3K/PTEN/AKT/TSC/mTORC1 Signaling Pathway. Dermatol Clin. 2017;35(1):51-60. doi: 10.1016/j.det.2016.07.001.Parker V.E.R., Keppler-Noreuil K.M., Faivre L., et al. Safety and efficacy of low-dose sirolimus in the PIK3CA-related overgrowth spectrum. Genet Med. 2019;21(5):1189-1198. doi: 10.1038/s41436-018-0297-9.Parker V.E.R., Keppler-Noreuil K.M., Faivre L., et al. Safety and efficacy of low-dose sirolimus in the PIK3CA-related overgrowth spectrum. Genet Med. 2019;21(5):1189-1198. doi: 10.1038/s41436-018-0297-9.Shagin D.A., Rebrikov D.V., Kozhemyako V.B., et al. A novel method for SNP detection using a new duplex-specific nuclease from crab hepatopancreas. Genome Res. 2002;12(12):1935-42. doi: 10.1101/gr.547002.Shagin D.A., Rebrikov D.V., Kozhemyako V.B., et al. A novel method for SNP detection using a new duplex-specific nuclease from crab hepatopancreas. Genome Res. 2002;12(12):1935-42. doi: 10.1101/gr.547002.Shagin D.A., Rebrikov D.V. Molecular biology applications of the red king crab duplex-specific nuclease. Bulletin of RSMU. 2022;(1):5–10. doi: 10.24075/brsmu.2022.010.Shagin D.A., Rebrikov D.V. Molecular biology applications of the red king crab duplex-specific nuclease. Bulletin of RSMU. 2022;(1):5–10. doi: 10.24075/brsmu.2022.010.Song C., Liu Y., Fontana R., et al. Elimination of unaltered DNA in mixed clinical samples via nuclease-assisted minor-allele enrichment. Nucleic Acids Res. 2016;44(19):e146. doi: 10.1093/nar/gkw650.Song C., Liu Y., Fontana R., et al. Elimination of unaltered DNA in mixed clinical samples via nuclease-assisted minor-allele enrichment. Nucleic Acids Res. 2016;44(19):e146. doi: 10.1093/nar/gkw650.Ladas I., Fitarelli-Kiehl M., Song C., et al. Multiplexed Elimination of Wild-Type DNA and High-Resolution Melting Prior to Targeted Resequencing of Liquid Biopsies. Clinical Chemistry. 2017;63(10):1605–1613. doi:10.1373/clinchem.2017.272849.Ladas I., Fitarelli-Kiehl M., Song C., et al. Multiplexed Elimination of Wild-Type DNA and High-Resolution Melting Prior to Targeted Resequencing of Liquid Biopsies. Clinical Chemistry. 2017;63(10):1605–1613. doi:10.1373/clinchem.2017.272849.Green M.R., Sambrook J. Isolation of High-Molecular-Weight DNA Using Organic Solvents. Cold Spring Harb Protoc. 2017;2017(4):pdb. prot093450. doi: 10.1101/pdb.prot093450.Green M.R., Sambrook J. Isolation of High-Molecular-Weight DNA Using Organic Solvents. Cold Spring Harb Protoc. 2017;2017(4):pdb. prot093450. doi: 10.1101/pdb.prot093450.Tanaka Y., Kanai F., Tada M., et al. Absence of PIK3CA hotspot mutations in hepatocellular carcinoma in Japanese patients. Oncogene. 2006;25(20):2950-2. doi: 10.1038/sj.onc.1209311.Tanaka Y., Kanai F., Tada M., et al. Absence of PIK3CA hotspot mutations in hepatocellular carcinoma in Japanese patients. Oncogene. 2006;25(20):2950-2. doi: 10.1038/sj.onc.1209311.Рыжкова О.П., Кардымон О.Л., Прохорчук Е.Б., и др. Руководство по интерпретации данных последовательности ДНК человека, полученных методами массового параллельного секвенирования (MPS) (редакция 2018, версия 2). Медицинская генетика. 2019;18(2):3-23. doi:10.25557/2073-7998.2019.02.3-23.Ryzhkova O.P., Kardymon O.L., Prohorchuk E.B., et al. Rukovodstvo po interpretatsii dannykh posledovatel’nosti DNK cheloveka, poluchennykh metodami massovogo parallel’nogo sekvenirovaniya (MPS) (redaktsiya 2018, versiya 2) [Guidelines for the interpretation of massive parallel sequencing variants (update 2018, v2)]. Meditsinskaya genetika [Medical Genetics]. 2019;18(2):3-23. (In Russ.)Davidson C.J., Zeringer E., Champion K.J., et al. Improving the limit of detection for Sanger sequencing: a comparison of methodologies for KRAS variant detection. Biotechniques. 2012;53(3):182-8. doi: 10.2144/000113913.Davidson C.J., Zeringer E., Champion K.J., et al. Improving the limit of detection for Sanger sequencing: a comparison of methodologies for KRAS variant detection. Biotechniques. 2012;53(3):182-8. doi: 10.2144/000113913.Сагоян Г.Б., Клецкая И.С., Имянитов Е.Н., и др. Спектр синдромов избыточного роста, связанных с мутацией PIK3CA. Обзор литературы. Российский журнал детской гематологии и онкологии (РЖДГиО). 2022;9(1):29-44. doi:10.21682/2311-1267-2022-9-1-29-44.Sagoyan G.B., Kletskaya I.S., Imyanitov Ye.N., et al. Spektr sindromov izbytochnogo rosta, svyazannykh s mutatsiyey PIK3CA. Obzor literatury [A spectrum of overgrowth syndromes associated with the PIK3CA mutation. Literature review]. Rossiyskiy zhurnal detskoy gematologii i onkologii [Russian Journal of Pediatric Hematology and Oncology]. 2022;9(1):29-44. (In Russ.) https://doi.org/10.21682/2311-1267-2022-9-1-29-44Singh S., Bradford D., Li X., et al. FDA Approval Summary: Alpelisib for PIK3CA-Related Overgrowth Spectrum. Clin Cancer Res. 2024;30(1):23–28. doi:10.1158/1078-0432.CCR-23-1270.Singh S., Bradford D., Li X., et al. FDA Approval Summary: Alpelisib for PIK3CA-Related Overgrowth Spectrum. Clin Cancer Res. 2024;30(1):23–28. doi:10.1158/1078-0432.CCR-23-1270.Angulo-Urarte A., Graupera M. When, where and which PIK3CA mutations are pathogenic in congenital disorders. Nat Cardiovasc Res. 2022;1(8):700–714. doi:10.1038/s44161-022-00107-8.Angulo-Urarte A., Graupera M. When, where and which PIK3CA mutations are pathogenic in congenital disorders. Nat Cardiovasc Res. 2022;1(8):700–714. doi:10.1038/s44161-022-00107-8

The authors declare that there are no conflicts of interest present.