medgenМедицинская генетикаMedical Genetics2073-7998Publishing House «Genius Media» LLC10.25557/2073-7998.2024.08.33-39medgen-2528Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯORIGINAL RESEARCHСкрининг направляющих РНК для восстановления рамки считывания в гене DMD методом геномного редактированияSingle guide RNAs screening for restoring the reading frame of the DMD gene by genome editingЛевченкоО. А.LevchenkoO. A.

Левченко О. А.

15522, г. Москва, ул. Москворечье, д. 1

Olga A. Levchenko

1, Moskvorechye st., Moscow, 115522

 

olia9998@gmail.comКочергин-НикитскийК. С.Kochergin-NikitskyK. S.

Кочергин-Никитский К. С.

15522, г. Москва, ул. Москворечье, д. 1

Kochergin-Nikitsky K. S.

1, Moskvorechye st., Moscow, 115522

ПанчукИ. О.PanchukI. O.

Панчук И. О.

15522, г. Москва, ул. Москворечье, д. 1

Panchuk I. O.

1, Moskvorechye st., Moscow, 115522

ВолодинаО. В.VolodinaO. V.

Володина О. В.

15522, г. Москва, ул. Москворечье, д. 1

Volodina O. V.

1, Moskvorechye st., Moscow, 115522

НагиеваС. Э.NagievaS. E.

Нагиева С. Э.

15522, г. Москва, ул. Москворечье, д. 1

Nagieva S. E.

1, Moskvorechye st., Moscow, 115522

КуршаковаЕ. В.KurshakovaE. V.

Куршакова Е. В.

15522, г. Москва, ул. Москворечье, д. 1

Kurshakova E. V.

1, Moskvorechye st., Moscow, 115522

ПетроваИ. О.PetrovaI. O.

Петрова И. О.

15522, г. Москва, ул. Москворечье, д. 1

Petrova I. O.

1, Moskvorechye st., Moscow, 115522

СмирнихинаС. А.SmirnikhinaS. A.

Смирнихина С. А.15522, г. Москва, ул. Москворечье, д. 1

Smirnikhina S. A.

1, Moskvorechye st., Moscow, 115522

ЛавровА. В.LavrovA. V.

Лавров А. В.

15522, г. Москва, ул. Москворечье, д. 1

Lavrov A. V.

1, Moskvorechye st., Moscow, 115522

ФГБНУ Медико-генетический научный центр им. академика Н.П. БочковаРоссияResearch Centre for Medical GeneticsRussian Federation2024271020242383339Copyright © Левченко О.А., Кочергин-Никитский К.С., Панчук И.О., Володина О.В., Нагиева С.Э., Куршакова Е.В., Петрова И.О., Смирнихина С.А., Лавров А.В., 20242024Левченко О.А., Кочергин-Никитский К.С., Панчук И.О., Володина О.В., Нагиева С.Э., Куршакова Е.В., Петрова И.О., Смирнихина С.А., Лавров А.В.Levchenko O.A., Kochergin-Nikitsky K.S., Panchuk I.O., Volodina O.V., Nagieva S.E., Kurshakova E.V., Petrova I.O., Smirnikhina S.A., Lavrov A.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.medgen-journal.ru/jour/article/view/2528

Мышечная дистрофия Дюшенна является самой распространённой мышечной дистрофией у детей. Причиной заболевания наиболее часто являются делеции экзонов 43-55 гена DMD, приводящие к сдвигу рамки считывания и отсутствию экспрессиифункционального белка дистрофина. Для восстановления рамки считывания наиболее оптимальным является подход пропускадополнительного экзона. Для того, чтобы удалить экзон полностью необходимо внести два двухцепочечных разрыва ДНК, что сопряжено с рядом негативных последствий. Однако перманентного пропуска экзона также можно добиться, разрушив сайт сплайсинга единственным разрывом ДНК с последующей репарацией путём негомологичного соединения концов. Для оценкивозможности реализации данной стратегии нами был проведен биоинформатический и  экспериментальный скрининг нРНК, направленных на сайты сплайсинга экзонов 43-55. В результате наиболее перспективными для редактирования подобным образом оказались акцепторные сайты сплайсинга экзонов 54-55 и донорные сайты сплайсинга экзонов 43 и 53. Кроме тогопоказана эффективность работы Cas9 с  неклассической PAM-последовательностью NGA.

 Duchenne muscular dystrophy is the most common muscular dystrophy among children. Mostly the cause of the disease is frame-shift deletions of exons 43-55 of the DMD gene, leading to the absence of expression of the functional dystrophin. The most optimal approachto restoring the reading frame is skipping an additional exon. In order to completely remove an exon, it is necessary to introduce two double-stranded DNA breaks, which is associated with a number of negative consequences. However, permanent exon skipping canalso be achieved by disruption the splice site by a single DNA break with following repair by non-homologous end joining. To assess the feasibility of this strategy, we performe a bioinformatics and experimental screening of sgRNAs targeting the splice sites of exons43-55. As a result, the most promising sites for editing were the acceptor splice sites of exons 54-55 and the donor splice sites of exons 43 and 53. In addition, we demonstrate the efficiency of Cas9 with the non-classical PAM sequence NGA. 

редактирование геномамышечная дистрофия ДюшеннаDMDэкзон-скиппингвосстановление рамки считыванияgenome editingDuchenne muscular dystrophyDMDexon skippingreading frame restorationИсследование выполнено за счёт гранта Российского научного фонда № 23-15-00482. The study was supported by grant No. 23-15-00482 from the Russian Science Foundation.ReferencesDuan D., Goemans N., Takeda S. et al. Duchenne muscular dystrophy. Nat. Rev. Dis. Prim. England. 2021; 7(1): 13.Duan D., Goemans N., Takeda S. et al. Duchenne muscular dystrophy. Nat. Rev. Dis. Prim. England. 2021; 7(1): 13.Bladen C.L., Salgado D., Monges S. et al. The TREAT-NMD DMD global database: Analysis of more than 7,000 duchenne muscular dystrophy mutations. Hum. Mutat. 2015;36(4):395-402.Bladen C.L., Salgado D., Monges S. et al. The TREAT-NMD DMD global database: Analysis of more than 7,000 duchenne muscular dystrophy mutations. Hum. Mutat. 2015;36(4):395-402.Straub V., Guglieri M. An update on Becker muscular dystrophy. Curr. Opin. Neurol. England. 2023; 36(5): 450–454.Straub V., Guglieri M. An update on Becker muscular dystrophy. Curr. Opin. Neurol. England. 2023; 36(5): 450–454.Chancellor D., Barrett D., Nguyen-Jatkoe L. et al. The state of cell and gene therapy in 2023. Mol. Ther. 2023; 31(12):3376-3388.Chancellor D., Barrett D., Nguyen-Jatkoe L. et al. The state of cell and gene therapy in 2023. Mol. Ther. 2023; 31(12):3376-3388.Hoy S.M. Delandistrogene Moxeparvovec: First Approval. Drugs. New Zealand. 2023; 83(14):1323-1329.Hoy S.M. Delandistrogene Moxeparvovec: First Approval. Drugs. New Zealand. 2023; 83(14):1323-1329.Monjaret F., Bourg N., Suel, L. et al. Cis-splicing and translation of the pre-trans-splicing molecule combine with efficiency in spliceosome-mediated RNA trans-splicing. Mol. Ther. 2014; 22(6):1176-1187.Monjaret F., Bourg N., Suel, L. et al. Cis-splicing and translation of the pre-trans-splicing molecule combine with efficiency in spliceosome-mediated RNA trans-splicing. Mol. Ther. 2014; 22(6):1176-1187.Barthélémy F., Wein N., Krahn M. et al. Translational research and therapeutic perspectives in dysferlinopathies. Mol. Med. 2011; 17(9-10):875-882.Barthélémy F., Wein N., Krahn M. et al. Translational research and therapeutic perspectives in dysferlinopathies. Mol. Med. 2011; 17(9-10):875-882.Athanasopoulos T., Munye M.M., Yáñez-Muñoz R.J. Nonintegrating Gene Therapy Vectors. Hematol Oncol Clin North Am. 2017; 31(5):753-770.Athanasopoulos T., Munye M.M., Yáñez-Muñoz R.J. Nonintegrating Gene Therapy Vectors. Hematol Oncol Clin North Am. 2017; 31(5):753-770.Izumi R., Takahashi T., Suzuki N. et al. The genetic profile of dysferlinopathy in a cohort of 209 cases: Genotype–phenotype relationship and a hotspot on the inner DysF domain. Hum. Mutat. 2020; 41(9):1540-1554.Izumi R., Takahashi T., Suzuki N. et al. The genetic profile of dysferlinopathy in a cohort of 209 cases: Genotype–phenotype relationship and a hotspot on the inner DysF domain. Hum. Mutat. 2020; 41(9):1540-1554.Pierce E.A., Aleman T.S., Jayasundera K.T. et al. Gene Editing for CEP290-Associated Retinal Degeneration. N. Engl. J. Med. 2024; 390(21):1972–1984.Pierce E.A., Aleman T.S., Jayasundera K.T. et al. Gene Editing for CEP290-Associated Retinal Degeneration. N. Engl. J. Med. 2024; 390(21):1972–1984.Gillmore J.D., Gane E., Taubel J. et al. CRISPR-Cas9 In Vivo Gene Editing for Transthyretin Amyloidosis. N. Engl. J. Med. 2021; 385(6):493-502.Gillmore J.D., Gane E., Taubel J. et al. CRISPR-Cas9 In Vivo Gene Editing for Transthyretin Amyloidosis. N. Engl. J. Med. 2021; 385(6):493-502.Hu J.H., Miller S.M., Geurts M.H. et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 2018; 556(7699): 57-63.Hu J.H., Miller S.M., Geurts M.H. et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 2018; 556(7699): 57-63.Sambrook J., Russell D.W. Preparation and Transformation of Competent E. coli Using Calcium Chloride. CSH Protoc. United States. 2006 Jun 1;2006(1):pdb.prot3932. doi: 10.1101/pdb.prot3932.Sambrook J., Russell D.W. Preparation and Transformation of Competent E. coli Using Calcium Chloride. CSH Protoc. United States. 2006 Jun 1;2006(1):pdb.prot3932. doi: 10.1101/pdb.prot3932.Hsu P.D., Scott D.A., Weinstein J.A. et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat. Biotechnol. United States. 2013; 31(9): 827-832.Hsu P.D., Scott D.A., Weinstein J.A. et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat. Biotechnol. United States. 2013; 31(9): 827-832.Doench J.G., Fusi N., Sullender M. et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPRCas9. Nat. Biotechnol. United States. 2016; 34(2): 184-191.Doench J.G., Fusi N., Sullender M. et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPRCas9. Nat. Biotechnol. United States. 2016; 34(2): 184-191.Zhang Y., Ge X., Yang F. et al. Comparison of non-canonical PAMs for CRISPR/Cas9-mediated DNA cleavage in human cells. Sci. ReС. 2014; 4: 1-5.Zhang Y., Ge X., Yang F. et al. Comparison of non-canonical PAMs for CRISPR/Cas9-mediated DNA cleavage in human cells. Sci. ReС. 2014; 4: 1-5.Wachutka L., Caizzi L., Gagneur J. et al. Global donor and acceptor splicing site kinetics in human cells. Elife. 2019; 8: 1-52.Wachutka L., Caizzi L., Gagneur J. et al. Global donor and acceptor splicing site kinetics in human cells. Elife. 2019; 8: 1-52.Amoasii L., Long C., Li H. et al. Single-cut genome editing restores dystrophin expression in a new mouse model of muscular dystrophy. Sci. Transl. Med. 2017; 9(418):eaan8081.Amoasii L., Long C., Li H. et al. Single-cut genome editing restores dystrophin expression in a new mouse model of muscular dystrophy. Sci. Transl. Med. 2017; 9(418):eaan8081.Kondratyeva E., Bukharova T., Efremova A. et al. Health Characteristics of Patients with Cystic Fibrosis whose Genotype Includes a Variant of the Nucleotide Sequence c.3140-16T>A and Functional Analysis of this Variant. Genes (Basel). 2021;12(6): 837.Kondratyeva E., Bukharova T., Efremova A. et al. Health Characteristics of Patients with Cystic Fibrosis whose Genotype Includes a Variant of the Nucleotide Sequence c.3140-16T>A and Functional Analysis of this Variant. Genes (Basel). 2021;12(6): 837.Min Y.L., Chemello F., Li H. et al. Correction of Three Prominent Mutations in Mouse and Human Models of Duchenne Muscular Dystrophy by Single-Cut Genome Editing. Mol. Ther. 2020;28(9):2044-2055.Min Y.L., Chemello F., Li H. et al. Correction of Three Prominent Mutations in Mouse and Human Models of Duchenne Muscular Dystrophy by Single-Cut Genome Editing. Mol. Ther. 2020;28(9):2044-2055.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.