medgenМедицинская генетикаMedical Genetics2073-7998Publishing House «Genius Media» LLC10.25557/2073-7998.2024.02.34-45medgen-2420Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯORIGINAL RESEARCHОсобенности валидации герминальных вариантов в гене PMS2 у пациентов с наследственными опухолевыми синдромамиValidation of PMS2 germline variants in patients with hereditary cancer syndromesРевковаМ. А.RevkovaM. A.

115162, г. Москва, ул. Лестева, д. 18

18, Lesteva st., Moscow, 115162

КриницинаА. А.KrinitsinaA. A.

115162, г. Москва, ул. Лестева, д. 18

18, Lesteva st., Moscow, 115162

НемцоваМ. В.NemtsovaM. V.

115162, г. Москва, ул. Лестева, д. 18

119991, г. Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2

115522, г. Москва, ул. Москворечье, д. 1

18, Lesteva st., Moscow, 115162

8, bldg. 2, Trubetskaya st., Moscow, 119991

1, Moskvorechie st., Moscow, 115478

МакароваМ. В.MakarovaM. V.

Макарова Мария Владимировна

115162, г. Москва, ул. Лестева, д. 18

117997, г. Москва, ул. Профсоюзная, д. 86

Maria V. Makarova

18, Lesteva st., Moscow, 115162

86, Profsoyuznaya st., 86, Moscow, 117997

makarova@evogenlab.ruЧерневскийД. К.ChernevskiyD. K

115162, г. Москва, ул. Лестева, д. 18

603005, г. Нижний Новгород, пл. Минина и Пожарского, д.10/1

18, Lesteva st., Moscow, 115162

10/1, Minin and Pozharsky Sq., Nizhny Novgorod, 603005

СагайдакО. В.SagaydakO. V.

115162, г. Москва, ул. Лестева, д. 18

18, Lesteva st., Moscow, 115162

МихайловВ. С.MikhailovV. S.

115162, г. Москва, ул. Лестева, д. 18

18, Lesteva st., Moscow, 115162

УлановаП. В.UlanovaP. V.

115162, г. Москва, ул. Лестева, д. 18

18, Lesteva st., Moscow, 115162

ЦукановА. С.TsukanovA. S.

123423, г. Москва,  ул. Саляма Адиля д. 2

2, Salyama Adilya st., Moscow, 123423

БяховаМ. М.ByakhovaM. M.

117152, г. Москва, Загородное ш., 18А, строение 7

18A bldg.7, Zagorodnoe shosse, Moscow, 117152

СеменоваА. Б.SemenovaA. B.

117152, г. Москва, Загородное ш., 18А, строение 7

18A bldg.7, Zagorodnoe shosse, Moscow, 117152

ГалкинВ. Н.GalkinV. N.

117152, г. Москва, Загородное ш., 18А, строение 7

18A bldg.7, Zagorodnoe shosse, Moscow, 117152

БабаджановаЧ. В.BabajanovaCh. V.

117152, г. Москва, Загородное ш., 18А, строение 7

18A bldg.7, Zagorodnoe shosse, Moscow, 117152

ДанишевичА. М.DanishevichA. M.

111123, г. Москва, ул. Новогиреевская, д.1, к.1

1, Novogireevskaya st., Moscow, 111123

БодуноваН. А.BodunovaN. A.

111123, г. Москва, ул. Новогиреевская, д.1, к.1

1, Novogireevskaya st., Moscow, 111123

ГаджиеваС. М.GadzhievaS. M.

127006, г. Москва, Оружейный пер., д. 43, стр.1

43, bldg. 1 Oruzheyny per., Moscow, 127006

БелиникинМ. С.BelinikinM. S.

115162, г. Москва, ул. Лестева, д. 18

18, Lesteva st., Moscow, 115162

ООО «Эвоген»РоссияLLC «Evogen»Russian FederationООО «Эвоген»; ФГАОУ ВО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский Университет); ФГБНУ «Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова»РоссияLLC «Evogen»; I.M. Sechenov First Moscow State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation (Sechenov University); Research Centre for Medical GeneticsRussian FederationООО «Эвоген»; ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Минздрава РоссииРоссияLLC «Evogen»; Russian Scientific Center of RoentgenoradiologyRussian FederationООО «Эвоген»; ФГБОУ ВО «Приволжский исследовательский медицинский университет»РоссияLLC «Evogen»; Privolzhsky Research Medical UniversityRussian FederationФГБУ «НМИЦ колопроктологии имени А.Н. Рыжих» Минздрава РоссииРоссияNational Medical Research Center of Coloproctology named after A. N. RyzhikhRussian FederationГБУЗ «Городская клиническая онкологическая больница №1 Департамента здравоохранения города Москвы»РоссияMoscow City Oncological Hospital No.1, Moscow Healthcare DepartmentRussian FederationГБУЗ «МКНЦ им. А.С. Логинова Департамента здравоохранения города Москвы»РоссияMoscow Clinical Scientific Center named after LoginovRussian FederationДепартамент здравоохранения г. МосквыРоссияMoscow Healthcare DepartmentRussian Federation2024250320242323445Copyright © Ревкова М.А., Криницина А.А., Немцова М.В., Макарова М.В., Черневский Д.К., Сагайдак О.В., Михайлов В.С., Уланова П.В., Цуканов А.С., Бяхова М.М., Семенова А.Б., Галкин В.Н., Бабаджанова Ч.В., Данишевич А.М., Бодунова Н.А., Гаджиева С.М., Белиникин М.С., 20242024Ревкова М.А., Криницина А.А., Немцова М.В., Макарова М.В., Черневский Д.К., Сагайдак О.В., Михайлов В.С., Уланова П.В., Цуканов А.С., Бяхова М.М., Семенова А.Б., Галкин В.Н., Бабаджанова Ч.В., Данишевич А.М., Бодунова Н.А., Гаджиева С.М., Белиникин М.С.Revkova M.A., Krinitsina A.A., Nemtsova M.V., Makarova M.V., Chernevskiy D.K., Sagaydak O.V., Mikhailov V.S., Ulanova P.V., Tsukanov A.S., Byakhova M.M., Semenova A.B., Galkin V.N., Babajanova C.V., Danishevich A.M., Bodunova N.A., Gadzhieva S.M., Belinikin M.S.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.medgen-journal.ru/jour/article/view/2420Введение

Введение.  Метод секвенирования по Сэнгеру в последние годы активно используется для валидации выявленных методом высокопроизводительного параллельного секвенирования (NGS) вариантов. Использование метода Сэнгера необходимо, когда выявленный вариант локализуется в гене, имеющем некоторое количество псевдогенов. Наличие псевдогенов осложняет поиск патогенных вариантов в белок-кодирующих участках. Ген PMS2, ассоциированный с синдромом Линча, имеет большое число псевдогенов  PMS2P1-PMS2P14 и  PMS2CL, поэтому для верификации выявленных патогенных вариантов требуются дополнительные методические подходы.

Цель

Цель:  отработать протокол валидации выявленных патогенных вариантов в гене PMS2 с учетом большого количества псевдогенов, имеющих высокий процент гомологии с участками, на которых расположены валидируемые варианты.

Методы

Методы. В статье представлены два случая с выявленными патогенными герминальными вариантами гена PMS2: chr7:5982823C>T (rs267608172) и chr7:6003716del (hg38).

Результаты

Результаты. Для валидации варианта chr7:5982823C>T (экзон 12 гена  PMS2), выявленного методом полногеномного секвенирования, разработана схема с использованием ПЦР с вложенными праймерами. В первом раунде проведена амплификация длинного фрагмента, содержащего 9-12 экзоны, во втором раунде – амплификация целевого фрагмента, пригодного для секвенирования методом Сэнгера. Для валидации варианта chr7:6003716del (экзон 4 гена  PMS2) праймеры подобраны так, чтобы различия нуклеотидной последовательности гена и псевдогена располагались на 3’-конце прямого праймера. В результате для дальнейшего секвенирования методом Сэнгера используется целевой фрагмент без примеси псевдогена.  Таким образом, чтобы избежать ошибок при анализе  PMS2  методом секвенирования по Сэнгеру необходимо использовать специфические методические подходы, чтобы высокогомологичные последовательности псевдогенов не мешали прочтению последовательности функционального гена.

Background

Background.  Next generation sequencing (NGS) has achieved unprecedented development in recent years. The Sanger sequencing method is actively used to validate variants identified using NGS. The use of the Sanger method is necessary when the identified variant is localized in a gene that has several pseudogenes. The presence of pseudogenes complicates the detection of pathogenic variants in protein-coding regions. The  PMS2 gene, associated with Lynch syndrome, has a large number of pseudogenes  PMS2P1-PMS2P14 and PMS2CL, so additional methodological approaches are required to verify the identified pathogenic variants.

Aim

Aim. Testing a validation protocol for identified  PMS2 gene pathogenic variants, taking into consideration the presence of numerous pseudogenes, which exhibit a high percentage of homology with the regions where the validated variants are found.

Methods

Methods. The article presents two cases with identified PMS2 gene pathogenic germline variants: chr7:5982823C>T (rs267608172) and chr7:6003716del (hg38).

Results

Results. We developed an algorithm using nested PCR primers to validate the chr7:5982823C>T variant ( PMS2 gene, exon 12) identified by whole-genome sequencing. In the first round, a long fragment containing exons 9-12 is amplified; in the second round, a target fragment suitable for Sanger sequencing is amplified. To validate the chr7:6003716del variant (PMS2 gene, exon 4), the primers were selected in a special way: the differences in the nucleotide sequence of the gene and the pseudogene were located at the 3’-end of the forward primer. As a result, further Sanger sequencing uses the target fragment without pseudogene contamination.

Conclusions

Conclusions.  Specialized algorithms for Sanger sequencing of the PMS2 gene are necessary to ensure that highly homologous pseudogene sequences do not interfere with reading the functional gene sequence.

PMS2высокопроизводительное секвенированиесеквенирование по Сэнгерунаследственные опухолевые синдромыPMS2next-generation sequencingSanger sequencinghereditary cancer syndromesИсследование проведено за счет средств гранта Департамента здравоохранения г. Москвы.This research was supported by the Moscow Healthcare Department.ReferencesVanin E.F. Processed pseudogenes: characteristics and evolution. Annu Rev Genet. 1985;19:253-72. doi: 10.1146/annurev.ge.19.120185.001345.Vanin E.F. Processed pseudogenes: characteristics and evolution. Annu Rev Genet. 1985;19:253-72. doi: 10.1146/annurev.ge.19.120185.001345.Claes K.B.M., Rosseel T., De Leeneer K. Dealing with Pseudogenes in Molecular Diagnostics in the Next Generation Sequencing Era. Methods Mol Biol. 2021;2324:363-381. doi: 10.1007/978-1-0716-1503-4_22.Claes K.B.M., Rosseel T., De Leeneer K. Dealing with Pseudogenes in Molecular Diagnostics in the Next Generation Sequencing Era. Methods Mol Biol. 2021;2324:363-381. doi: 10.1007/978-1-0716-1503-4_22.van der Klift H.M., Tops C.M., Bik E.C., et al. Quantification of sequence exchange events between PMS2 and PMS2CL provides a basis for improved mutation scanning of Lynch syndrome patients. Hum Mutat. 2010 May;31(5):578-87. doi: 10.1002/humu.21229.van der Klift H.M., Tops C.M., Bik E.C., et al. Quantification of sequence exchange events between PMS2 and PMS2CL provides a basis for improved mutation scanning of Lynch syndrome patients. Hum Mutat. 2010 May;31(5):578-87. doi: 10.1002/humu.21229.Clendenning M., Hampel H., LaJeunesse J., et al. Long-range PCR facilitates the identification of PMS2-specific mutations. Hum Mutat. 2006 May;27(5):490-5. doi: 10.1002/humu.20318. Erratum in: Hum Mutat. 2006;27(11):1155.Clendenning M., Hampel H., LaJeunesse J., et al. Long-range PCR facilitates the identification of PMS2-specific mutations. Hum Mutat. 2006 May;27(5):490-5. doi: 10.1002/humu.20318. Erratum in: Hum Mutat. 2006;27(11):1155.Vaughn C.P., Robles J., Swensen J.J., et al. Clinical analysis of PMS2: mutation detection and avoidance of pseudogenes. Hum Mutat. 2010;31(5):588-93. doi: 10.1002/humu.21230.Vaughn C.P., Robles J., Swensen J.J., et al. Clinical analysis of PMS2: mutation detection and avoidance of pseudogenes. Hum Mutat. 2010;31(5):588-93. doi: 10.1002/humu.21230.Рыжкова О.П., Кардымон О.Л., Прохорчук Е.Б., и др. Руководство по интерпретации данных последовательности ДНК человека, полученных методами массового параллельного секвенирования (MPS) (редакция 2018, версия 2). Медицинская генетика. 2019;18(2):3-23. https://doi.org/10.25557/2073-7998.2019.02.3-23Ryzhkova O.P., Kardymon O.L., Prokhorchuk E.B., et al. Rukovodstvo po interpretatsii dannykh posledovatel’nosti DNK cheloveka, poluchennykh metodami massovogo parallel’nogo sekvenirovaniya (MPS) (redaktsiya 2018, versiya 2) [Guidelines for the Interpretation of Human DNA Sequence Data Obtained by Massive Parallel Sequencing (MPS) Methods (Edition 2018, Version 2)]. Meditsinskaya genetika [Medical genetics]. 2019;18(2):3-23. (In Russ.) https://doi.org/10.25557/2073-7998.2019.02.3-23Hereditary Cancer Syndromes and Risk Assessment: ACOG COMMITTEE OPINION, Number 793. Obstet Gynecol. 2019;134(6):e143-e149. doi: 10.1097/AOG.0000000000003562.Hereditary Cancer Syndromes and Risk Assessment: ACOG COMMITTEE OPINION, Number 793. Obstet Gynecol. 2019;134(6):e143-e149. doi: 10.1097/AOG.0000000000003562.Nicolaides N.C., Papadopoulos N., Liu B., et al. Mutations of two PMS homologues in hereditary nonpolyposis colon cancer. Nature. 1994;371(6492):75-80. doi: 10.1038/371075a0.Nicolaides N.C., Papadopoulos N., Liu B., et al. Mutations of two PMS homologues in hereditary nonpolyposis colon cancer. Nature. 1994;371(6492):75-80. doi: 10.1038/371075a0.Senter L., Clendenning M., Sotamaa K., et al. The clinical phenotype of Lynch syndrome due to germline PMS2 mutations. Gastroenterology. 2008;135(2):419-28. doi: 10.1053/j.gastro.2008.04.026.Senter L., Clendenning M., Sotamaa K., et al. The clinical phenotype of Lynch syndrome due to germline PMS2 mutations. Gastroenterology. 2008;135(2):419-28. doi: 10.1053/j.gastro.2008.04.026.Ten Broeke S.W., van der Klift H.M., Tops C.M.J., et al. Cancer Risks for PMS2-Associated Lynch Syndrome. J Clin Oncol. 2018;36(29):2961-2968. doi: 10.1200/JCO.2018.78.4777. Erratum in: J Clin Oncol. 2019 Mar 20;37(9):761.Ten Broeke S.W., van der Klift H.M., Tops C.M.J., et al. Cancer Risks for PMS2-Associated Lynch Syndrome. J Clin Oncol. 2018;36(29):2961-2968. doi: 10.1200/JCO.2018.78.4777. Erratum in: J Clin Oncol. 2019 Mar 20;37(9):761.Cannavo E., Marra G., Sabates-Bellver J., et al. Expression of the MutL homologue hMLH3 in human cells and its role in DNA mismatch repair. Cancer Res. 2005;65(23):10759-66. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-05-2528.Cannavo E., Marra G., Sabates-Bellver J., et al. Expression of the MutL homologue hMLH3 in human cells and its role in DNA mismatch repair. Cancer Res. 2005;65(23):10759-66. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-05-2528.Korhonen M.K., Raevaara T.E., Lohi H., Nyström M. Conditional nuclear localization of hMLH3 suggests a minor activity in mismatch repair and supports its role as a low-risk gene in HNPCC. Oncol Rep. 2007;17(2):351-4.Korhonen M.K., Raevaara T.E., Lohi H., Nyström M. Conditional nuclear localization of hMLH3 suggests a minor activity in mismatch repair and supports its role as a low-risk gene in HNPCC. Oncol Rep. 2007;17(2):351-4.ten Broeke S.W., Brohet R.M., Tops C.M., et al. Lynch syndrome caused by germline PMS2 mutations: delineating the cancer risk. J Clin Oncol. 2015;33(4):319-25. doi: 10.1200/JCO.2014.57.8088.ten Broeke S.W., Brohet R.M., Tops C.M., et al. Lynch syndrome caused by germline PMS2 mutations: delineating the cancer risk. J Clin Oncol. 2015;33(4):319-25. doi: 10.1200/JCO.2014.57.8088.Шелыгин Ю.А., Ачкасов С.И., Семёнов Д.А., и др. Генетические и фенотипические характеристики 60 российских семей с синдромом Линча. Колопроктология. 2021;20(3):35–42. http://dx.doi.org/10.33878/2073-7556-2021-20-3-35-42Shelygin Y.A., Achkasov S.I., Semenov D.A., et al. Geneticheskiye i fenotipicheskiye kharakteristiki 60 rossiyskikh semey s sindromom Lincha [Genetic and phenotypic characteristics of 60 Russian families with Lynch syndrome]. Koloproktologiâ [Coloproctology]. 2021;20(3):35–42. (In Russ.) http://dx.doi.org/10.33878/2073-7556-2021-20-3-35-42Kasela M., Nyström M., Kansikas M. PMS2 expression decrease causes severe problems in mismatch repair. Hum Mutat. 2019;40(7):904-907. doi: 10.1002/humu.23756.Kasela M., Nyström M., Kansikas M. PMS2 expression decrease causes severe problems in mismatch repair. Hum Mutat. 2019;40(7):904-907. doi: 10.1002/humu.23756.Hendriks Y.M., Jagmohan-Changur S., van der Klift H.M., et al. Heterozygous mutations in PMS2 cause hereditary nonpolyposis colorectal carcinoma (Lynch syndrome). Gastroenterology. 2006;130(2):312-22. doi: 10.1053/j.gastro.2005.10.052.Hendriks Y.M., Jagmohan-Changur S., van der Klift H.M., et al. Heterozygous mutations in PMS2 cause hereditary nonpolyposis colorectal carcinoma (Lynch syndrome). Gastroenterology. 2006;130(2):312-22. doi: 10.1053/j.gastro.2005.10.052.Clendenning M., Hampel H., LaJeunesse J., et al. Long-range PCR facilitates the identification of PMS2-specific mutations. Hum Mutat. 2006;27(5):490-5. doi: 10.1002/humu.20318. Erratum in: Hum Mutat. 2006;27(11):1155.Clendenning M., Hampel H., LaJeunesse J., et al. Long-range PCR facilitates the identification of PMS2-specific mutations. Hum Mutat. 2006;27(5):490-5. doi: 10.1002/humu.20318. Erratum in: Hum Mutat. 2006;27(11):1155.Vaughn C.P., Robles J., Swensen J.J., et al. Clinical analysis of PMS2: mutation detection and avoidance of pseudogenes. Hum Mutat. 2010;31(5):588-93. doi: 10.1002/humu.21230.Vaughn C.P., Robles J., Swensen J.J., et al. Clinical analysis of PMS2: mutation detection and avoidance of pseudogenes. Hum Mutat. 2010;31(5):588-93. doi: 10.1002/humu.21230.Li J., Dai H., Feng Y., et al. A Comprehensive Strategy for Accurate Mutation Detection of the Highly Homologous PMS2. J Mol Diagn. 2015;17(5):545-53. doi: 10.1016/j.jmoldx.2015.04.001.Li J., Dai H., Feng Y., et al. A Comprehensive Strategy for Accurate Mutation Detection of the Highly Homologous PMS2. J Mol Diagn. 2015;17(5):545-53. doi: 10.1016/j.jmoldx.2015.04.001.Nicolaides N.C., Kinzler K.W., Vogelstein B. Analysis of the 5’ region of PMS2 reveals heterogeneous transcripts and a novel overlapping gene. Genomics. 1995;29(2):329-34. doi: 10.1006/geno.1995.9997.Nicolaides N.C., Kinzler K.W., Vogelstein B. Analysis of the 5’ region of PMS2 reveals heterogeneous transcripts and a novel overlapping gene. Genomics. 1995;29(2):329-34. doi: 10.1006/geno.1995.9997.Hayward B.E., De Vos M., Valleley E.M., et al. Extensive gene conversion at the PMS2 DNA mismatch repair locus. Hum Mutat. 2007;28(5):424-30. doi: 10.1002/humu.20457. PMID: 17253626.Hayward B.E., De Vos M., Valleley E.M., et al. Extensive gene conversion at the PMS2 DNA mismatch repair locus. Hum Mutat. 2007;28(5):424-30. doi: 10.1002/humu.20457. PMID: 17253626.Auclair J., Leroux D., Desseigne F., et al. Novel biallelic mutations in MSH6 and PMS2 genes: gene conversion as a likely cause of PMS2 gene inactivation. Hum Mutat. 2007;28(11):1084-90. doi: 10.1002/humu.20569.Auclair J., Leroux D., Desseigne F., et al. Novel biallelic mutations in MSH6 and PMS2 genes: gene conversion as a likely cause of PMS2 gene inactivation. Hum Mutat. 2007;28(11):1084-90. doi: 10.1002/humu.20569.Ganster C., Wernstedt A., Kehrer-Sawatzki H., et al. Functional PMS2 hybrid alleles containing a pseudogene-specific missense variant trace back to a single ancient intrachromosomal recombination event. Hum Mutat. 2010;31(5):552-60. doi: 10.1002/humu.21223.Ganster C., Wernstedt A., Kehrer-Sawatzki H., et al. Functional PMS2 hybrid alleles containing a pseudogene-specific missense variant trace back to a single ancient intrachromosomal recombination event. Hum Mutat. 2010;31(5):552-60. doi: 10.1002/humu.21223.Семенова А. Б., Бяхова М. М., Галкин В. Н., и др. Возможности молекулярно-генетических методов для эффективного выявления наследственных форм онкологических заболеваний среди лиц с повышенными рисками их развития. Здоровье мегаполиса. 2023; 4(2):30-40. doi:10.47619/2713-2617.zm.2023.v.4i2;30-40.Semenova A. B., Byakhova M. M., Galkin V. N., et al. Vozmozhnosti molekulyarno-geneticheskikh metodov dlya effektivnogo vyyavleniya nasledstvennykh form onkologicheskikh zabolevaniy sredi lits s povyshennymi riskami ikh razvitiya [Capabilities of Molecular Genetic Methods for Effective Hereditary Cancers Detection in Individuals with High Cancer Risk Factors]. Zdorov’ye megapolisa [City Healthcare Journal]. 2023; 4(2):30-40. (In Russ.) doi:10.47619/2713-2617.zm.2023.v.4i2;30-40.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.