medgenМедицинская генетикаMedical Genetics2073-7998Publishing House «Genius Media» LLC10.25557/2073-7998.2023.06.3-11medgen-2316Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯORIGINAL RESEARCHНовые варианты нуклеотидных последовательностей гена DYSF, выявленные методом секвенирования нового поколенияNew nucleotide sequence variants of the DYSF gene, identified by the next-generation sequencingИсаевА. А.IsaevA. A.

119333, г. Москва, ул. Губкина, д.3, стр.2, а/я 373

119333, г. Москва, ул. Губкина, д. 3, корп.1

3, bldg. 2, Gubkina st., PO box 373, Moscow, 119333

3, bldg.1, Gubkina st., Moscow, 119333

БардаковС. Н.BardakovS. N.

194044, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д. 6

6, Academician Lebedeva st., St. Petersburg, 194044

МкртчянЛ. А.MkrtchyanL. A.

Мкртчян Лилит Арменовна

121614, г. Москва, вн.тер. г. Муниципальный Округ Крылатское, ул. Крылатские Холмы, д. 32, к. 2

Lilit A. Mkrtchyan

32, bldg.2, Krylatskie Holmy st., Moscow, 121614

lilit@genotarget.comМусатоваЕ. В.MusatovaE. V.

119333, г. Москва, ул. Губкина, д. 3, корп.1

3, bldg.1, Gubkina st., Moscow, 119333

ХмельковаД, Н.KhmelkovaD. N.

119333, г. Москва, ул. Губкина, д. 3, корп.1

3, bldg.1, Gubkina st., Moscow, 119333

ГусеваМ. В.GusevaM. V.

119333, г. Москва, ул. Губкина, д. 3, корп.1

3, bldg.1, Gubkina st., Moscow, 119333

КаймоновВ. С.KaimonovV. S.

119333, г. Москва, ул. Губкина, д. 3, корп.1

3, bldg.1, Gubkina st., Moscow, 119333

ЯковлевИ. А.YakovlevI. A.

119333, г. Москва, ул. Губкина, д.3, стр.2, а/я 373

119333, г. Москва, ул. Губкина, д. 3, корп.1

3, bldg. 2, Gubkina st., PO box 373, Moscow, 1193333

bldg.1, Gubkina st., Moscow, 119333

ДеевР. В.Deev R.V.R. V.

119333, г. Москва, ул. Губкина, д.3, стр.2, а/я 373

121614, г. Москва, вн.тер. г. Муниципальный Округ Крылатское, ул. Крылатские Холмы, д. 32, к. 2

191015, г. Санкт-Петербург, ул. Кирочная, д. 41

3, bldg. 2, Gubkina st., PO box 373, Moscow, 119333

32, bldg.2, Krylatskie Holmy st., Moscow, 121614

ПАО “Институт стволовых клеток человека”; ПАО “Центр генетики и репродуктивной медицины “Генетико”РоссияPublic joint stock company “Human Stem Cells Institute”; Public joint stock company “Genetico” Center for Genetics and Reproductive MedicineRussian FederationФГБВОУ ВО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» Министерства обороны Российской ФедерацииРоссия“Military Medical Academy named after S.M. Kirov”Russian FederationООО «Генотаргет»РоссияLimited liability Company “Genotarget”Russian FederationПАО “Центр генетики и репродуктивной медицины “Генетико”РоссияPublic joint stock company “Genetico” Center for Genetics and Reproductive MedicineRussian FederationПАО “Институт стволовых клеток человека”; ПАО “Центр генетики и репродуктивной медицины “Генетико”РоссияPublic joint stock company “Human Stem Cells Institute”;Public joint stock company “Genetico” Center for Genetics and Reproductive MedicineRussian FederationПАО “Институт стволовых клеток человека”; ООО «Генотаргет»; ФГБОУ ВО «Северо-Западный государственный медицинский университет имени И. И. Мечникова» Министерства здравоохранения Российской ФедерацииРоссияPublic joint stock company “Human Stem Cells Institute”; Limited liability Company “Genotarget”Russian Federation202313102023226311Copyright © Исаев А.А., Бардаков С.Н., Мкртчян Л.А., Мусатова Е.В., Хмелькова Д.Н., Гусева М.В., Каймонов В.С., Яковлев И.А., Деев Р.В., 20232023Исаев А.А., Бардаков С.Н., Мкртчян Л.А., Мусатова Е.В., Хмелькова Д.Н., Гусева М.В., Каймонов В.С., Яковлев И.А., Деев Р.В.Isaev A.A., Bardakov S.N., Mkrtchyan L.A., Musatova E.V., Khmelkova D.N., Guseva M.V., Kaimonov V.S., Yakovlev I.A., Deev R.V. R.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.medgen-journal.ru/jour/article/view/2316Введение

Введение. Среди поясно-конечностных мышечных дистрофий (ПКМД) по частоте встречаемости дисферлинопатия занимает второе место в мире после кальпаинопатии. Заболевание характеризуется относительно поздней манифестацией, а сходная клиническая картина в группе ПКМД в ряде случаев создает значимые сложности в дифференциальной диагностике. Методом секвенирования нового поколения (NGS) можно быстро и эффективно определить вариант нуклеотидной последовательности гена DYSF, приводящий к нарушению синтеза белка дисферлина.

Цель исследования

Цель исследования: определить эффективность выявления вариантов нуклеотидных последовательностей в гене DYSF методом NGS у пациентов с клиническим диагнозом диферлинопатия и оценить возможности данного метода в дифференциальной диагностике ПКМД.

Методы

Методы. Поиск генетических вариантов в гене DYSF производился у 157 пациентов при наличии клинических проявлений ПКМД, сопровождающихся повышением уровня креатинфосфокиназы (КФК) в 10-100 раз, манифестацией в возрасте 2-73 лет. У 27 пациентов выявлены изменения в последовательности гена DYSF. Методом Сэнгера было обследовано 9 из 27 человек – 34 (15-58)%. 18 пациентов было обследовано методом NGS, что составляет 67(42-85)%. У 2 родственных пациентов, у которых был выявлен только один вариант измененной последовательности гена DYSF, для поиска крупных делеций и (или) дупликаций была проведена мультиплексная лигаза-зависимая амплификация (MLPA). Выявленные методом NGS генетические варианты верифицировались референтным методом – ПЦР. Гистологическое и иммуногистологическое исследование выполнено четырем пациентам с неоднозначным результатом молекулярно-генетической диагностики. В качестве биоптата забран фрагмент (5 мм3) латеральной головки четырехглавой мышцы бедра.

Результаты и выводы

Результаты и выводы. Методом NGS в гене DYSF был выявлен 21 различный генетический вариант у 27 пациентов. 16 из 21генетических вариантов ранее описаны; в четверти случаев (5 вариантов, 25(0-52)%) генетические варианты являются ранее не описанными (novel). Из 21 выявленного варианта на основании критериев ACMG 12 (57(31-81)%)  были классифицированы как патогенные, 5 (25(0-51)%) – как вероятно патогенные, 4 (20(0-46)%) – как варианты с неизвестной клинической значимостью.

Background

Background. According to the frequency of occurrences dysferlinopathy occupies the second place in world among limb–girdle muscular dystrophy (LGMD) after calpainopathy. The disease has a relatively late manifestation and the similar clinical picture with other LGMD. In some cases, that creates significant difficulties in differential diagnostics. New generation sequencing (NGS) is method that quickly and efficiently allows to determine the variant of the DYSF gene that leads to violation of protein synthesis.

Aim

Aim: to determine the effectiveness of identifying variants of nucleotide sequences in the DYSF gene by the NGS in patients with aclinical diagnosis of diferlinopathy and also to evaluate the possibilities of this method in differential diagnostics of LGMD.

Methods

Methods. The search for genetic variants of the DYSF gene was performed in patients with detected phenotype of LGMD, as well as 10 to 100 times higher levels of creatine kinase (CK) and manifestation at the age of 2-73 years. In total, 157 patients with a clinical signs of LGMD were included in the study. Changes in the sequence of the DYSF gene were detected in 27 of them. 9 of 27 people – 34(15-58)% were examined with Sanger sequencing. 18 of them – 67(42-85)% were examined by the NGS method. In two patients only one changed variant in the DYSF gene was detected, in this regard multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) was performed to search for large deletions and (or) duplications. The identified genetic variants were verified by the reference method – PCR. Histological and immunohistological examination was performed in four patients with ambiguous results. As a biopsy material for examination were used fragments (5 mm3) of the lateral head of the quadriceps femoral muscle.

Results and conclusions

Results and conclusions. Using the NGS method, in 27 patients 21 genetic variant of the DYSF gene was identified. 16 variants out of 21 belong to the category of previously described; thus, in almost a quarter of cases (5) – 25(0-52)% variants weren’t described before (novel). Among the 21 identified variants, based on ACMG criteria, 12 – 57(31-81)% variants were classified as pathogenic, 5 – 25(0-51)% as probably pathogenic and 4 – 20(0-46)% as variants with uncertain significance, however, all detected variants were accompanied by a detailed clinical signs of LGMD.

секвенированиеNGSдисферлиндисферлинопатияПКМД R2 (2B)sequencingNGSdysferlindysferlinopathyLGMD R2 (LGMD 2B)ReferencesЧернова О.Н., Мавликеев М.О., Зейналова А.К. с соавт. Репаративный рабдомиогистогенез у мышей, мутантных по гену DYSF. Гены и клетки 2019; 14(2): 32-39.Chernova O.N., Mavlikeev M.O., Zeynalova A.K., et al. Reparativnyy rabdomiogistogenez u myshey, mutantnykh po genu DYSF [Reparative rhabdomyogenesis in mice with DYSF mutation]. Geny i kletki [Genes and cells]. 2019;14(2):32-39. (In Russ.)Царгуш В.А., Бардаков С.Н., Багненко С.С. с соавт. Магнитно-резонансный паттерн изменений мышц тазового пояса и нижних конечностей у пациентов с дисферлинопатиями. Лучевая диагностика и терапия 2020; 11(1): 93-105.Tsargush V.A., Bardakov S.N., Bagnenko S.S. et. al. Magnitnorezonansnyy pattern izmeneniy myshts tazovogo poyasa i nizhnikh konechnostey u patsiyentov s disferlinopatiyami [MRI pattern changes in pelvic muscle and lower limb in patients with dysferlinopathy]. Luchevaya diagnostika i terapiya [Diagnostic radiology and radiotherapy]. 2020;11(1):93-105. (In Russ.)Guglieri M., Magri F., D’Angelo M.G. et al. Clinical, molecular, and protein correlations in a large sample of genetically diagnosed Italian limb girdle muscular dystrophy patients. Hum Mutat. 2008; 29(2): 258–266.Guglieri M., Magri F., D’Angelo M.G. et al. Clinical, molecular, and protein correlations in a large sample of genetically diagnosed Italian limb girdle muscular dystrophy patients. Hum Mutat. 2008;29(2):258–266.Бардаков С.Н., Емелин А.М., Никитин С.С., и др. Причины ложной диагностики полимиозита у пациентов с дисферлинопатией: клинический случай. Нервно-мышечные болезни. 2022;12(4):73-87.Bardakov S.N., Emelin A.М., Nikitin S.S., et al. Prichiny lozhnoy diagnostiki polimiozita u patsiyentov s disferlinopatiyey: klinicheskiy sluchay [Reasons for misdiagnosis of polymyositis in patients with dysferlinopathy: a clinical case]. Nervno-myshechnyye bolezni [Neuromuscular Diseases]. 2022;12(4):73-87. (In Russ.)Bushby K.M. Making sense of the limb-girdle muscular dystrophies. Brain. 1999;122(8):1403–1420.Bushby K.M. Making sense of the limb-girdle muscular dystrophies. Brain. 1999;122(8):1403–1420.Diers A., Carl M., Stoltenburg-Didinger G. et al. Painful enlargement of the calf muscles in limb girdle muscular dystrophy type 2B (LGMD2B) with a novel compound heterozygous mutation in DYSF. Neuromuscular Disorders. 2007;17(2):157–162.Diers A., Carl M., Stoltenburg-Didinger G. et al. Painful enlargement of the calf muscles in limb girdle muscular dystrophy type 2B (LGMD2B) with a novel compound heterozygous mutation in DYSF. Neuromuscular Disorders. 2007;17(2):157–162.Landrum M.J., Lee J.M., Benson M. et al. ClinVar: improving access to variant interpretations and supporting evidence. Nucleic Acids Res. 2018.Landrum M.J., Lee J.M., Benson M. et al. ClinVar: improving access to variant interpretations and supporting evidence. Nucleic Acids Res. 2018.Vilchez J.J., Gallano P., Gallardo E. et al. Identification of a Novel Founder Mutation in the DYSF Gene Causing Clinical Variability in the Spanish Population. Archives of Neurology. 2005;62(8):1256.Vilchez J.J., Gallano P., Gallardo E. et al. Identification of a Novel Founder Mutation in the DYSF Gene Causing Clinical Variability in the Spanish Population. Archives of Neurology. 2005;62(8):1256.Cagliani R., Fortunato F., Giorda R. et al. Molecular analysis of LGMD-2B and MM patients: identification of novel DYSF mutations and possible founder effect in the Italian population. Neuromuscular Disorders.2003;13(10):788–795.Cagliani R., Fortunato F., Giorda R. et al. Molecular analysis of LGMD-2B and MM patients: identification of novel DYSF mutations and possible founder effect in the Italian population. Neuromuscular Disorders.2003;13(10):788–795.Leshinsky-Silver E., Argov Z., Rozenboim L. et al. Dysferlinopathy in the Jews of the Caucasus: A frequent mutation in the dysferlin gene. Neuromuscular Disorders. 2007;17(11-12):950–954.Leshinsky-Silver E., Argov Z., Rozenboim L. et al. Dysferlinopathy in the Jews of the Caucasus: A frequent mutation in the dysferlin gene. Neuromuscular Disorders. 2007;17(11-12):950–954.Illarioshkin S.N., Ivanova-Smolenskaya I.A., Greenberg C.R. et al. Identical dysferlin mutation in limb-girdle muscular dystrophy type 2b and distal myopathy. Neurology. 2000;55(12):1931–1933.Illarioshkin S.N., Ivanova-Smolenskaya I.A., Greenberg C.R. et al. Identical dysferlin mutation in limb-girdle muscular dystrophy type 2b and distal myopathy. Neurology. 2000;55(12):1931–1933.Коновалов Ф.А., Федотов В.П., Умаханова З.Р. и соавт. Молекулярная диагностика наследственных миопатий методом полноэкзомного секвенирования. Медицинская генетика. 2015;14(3):18-19Konovalov F.A., Fedotov V.P., Umakhanova Z.R. et al. Molekulyarnaya diagnostika nasledstvennykh miopatiy metodom polnoekzomnogo sekvenirovaniya [Molecular diagnostics of hereditary myopathies by full-exome sequencing]. Meditsinskaya Genetika [Medical Genetics]. 2015;14(3):18-19. (In Russ.)Ampleeva M., Tolmacheva E., Komarkov I. et al. NGS-based testing in diagnostics of hereditary neuro-muscular disorders: observations on a large cohort from a clinical bioinformatician’s perspective. Eur J Hum Genet. 2020. https://www.nature.com/articles/s41431-020-00739-z.Ampleeva M., Tolmacheva E., Komarkov I. et al. NGS-based testing in diagnostics of hereditary neuro-muscular disorders: observations on a large cohort from a clinical bioinformatician’s perspective. Eur J Hum Genet. 2020. https://www.nature.com/articles/s41431-020-00739-z.Шаркова И.В., Дадали Е.Л. Клинико-генетические характеристики и алгоритм дифференциальной диагностики прогрессирующих мышечных дистрофий, манифестирующих после периода нормального моторного развития. Нервно-мышечные болезни. 2023;13(1):44-51.Sharkova I.V., Dadali E.L. Kliniko-geneticheskiye kharakteristiki i algoritm differentsial’noy diagnostiki progressiruyushchikh myshechnykh distrofiy, manifestiruyushchikh posle perioda normal’nogo motornogo razvitiya [Clinical and genetic characteristics and an algorithm for the differential diagnosis of progressive muscular dystrophies that manifest after a period of normal motor development]. Nervno-myshechnyye bolezni [Neuromuscular Diseases]. 2023;13(1):44-51. (In Russ.)Щагина О.А., Рыжкова О.П., Чухрова А.Л., и др. Применение экзомного секвенирования для диагностики наследственных моторно-сенсорных нейропатий. Нервно-мышечные болезни 2020;10(4):12-26.Shchagina O.A., Ryzhkova O.P., Chukhrova A.L., et al. Primeneniye ekzomnogo sekvenirovaniya dlya diagnostiki nasledstvennykh motornosensornykh neyropatiy Diagnostic utility of exome sequencing for inherited peripheral neuropathies. Nervno-myshechnyye bolezni Neuromuscular Diseases. 2020;10(4):12-26. (In Russ.)Miller D.T., Lee K., Abul-Husn N.S., et al. ACMG SF v3.1 list for reporting of secondary findings in clinical exome and genome sequencing: A policy statement of the American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG). Genet Med. 2022;24(7):1407-1414.Miller D.T., Lee K., Abul-Husn N.S., et al. ACMG SF v3.1 list for reporting of secondary findings in clinical exome and genome sequencing: A policy statement of the American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG). Genet Med. 2022;24(7):1407-1414.Harris E., Bladen C.L., Mayhew A. et al. The Clinical Outcome Study for dysferlinopathy: An international multicenter study. Neurol Genet. 2016;2(4):89.Harris E., Bladen C.L., Mayhew A. et al. The Clinical Outcome Study for dysferlinopathy: An international multicenter study. Neurol Genet. 2016;2(4):89.Nguyen K., Bassez G., Bernard R. et al. Dysferlin mutations in LGMD2B, Miyoshi myopathy, and atypical dysferlinopathies. Hum Mutat. 2005;26:165.Nguyen K., Bassez G., Bernard R. et al. Dysferlin mutations in LGMD2B, Miyoshi myopathy, and atypical dysferlinopathies. Hum Mutat. 2005;26:165.Nguyen K., Bassez G., Krahn M. et al. 2. Phenotypic study in 40 patients with dysferlin gene mutations: high frequency of atypical phenotypes. Arch Neurol. 2007;64(8):1176–1182.Nguyen K., Bassez G., Krahn M. et al. 2. Phenotypic study in 40 patients with dysferlin gene mutations: high frequency of atypical phenotypes. Arch Neurol. 2007;64(8):1176–1182.Aoki M., Liu J., Richard I. et al. Genomic organization of the dysferlin gene and novel mutations in Miyoshi myopathy. Neurology. 2001;57(2):271-278.Aoki M., Liu J., Richard I. et al. Genomic organization of the dysferlin gene and novel mutations in Miyoshi myopathy. Neurology. 2001;57(2):271-278.Cagliani R., Magri F., Toscano A. et al. Mutation finding in patients with dysferlin deficiency and role of the dysferlin interacting proteins annexin A1 and A2 in muscular dystrophies. Hum Mutat. 2005;26(3):283.Cagliani R., Magri F., Toscano A. et al. Mutation finding in patients with dysferlin deficiency and role of the dysferlin interacting proteins annexin A1 and A2 in muscular dystrophies. Hum Mutat. 2005;26(3):283.Cacciottolo M., Numitone G., Aurino S. et al. Muscular dystrophy with marked Dysferlin deficiency is consistently caused by primary dysferlin gene mutations. European Journal of Human Genetics.2011;19(9):974–980.Cacciottolo M., Numitone G., Aurino S. et al. Muscular dystrophy with marked Dysferlin deficiency is consistently caused by primary dysferlin gene mutations. European Journal of Human Genetics.2011;19(9):974–980.Jin S.Q., Yu M., Zhang W. et al. Dysferlin Gene Mutation Spectrum in a Large Cohort of Chinese Patients with Dysferlinopathy. Chin Med J (Engl). 2016;129(19):2287-2293.Jin S.Q., Yu M., Zhang W. et al. Dysferlin Gene Mutation Spectrum in a Large Cohort of Chinese Patients with Dysferlinopathy. Chin Med J (Engl). 2016;129(19):2287-2293.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.