medgenМедицинская генетикаMedical Genetics2073-7998Publishing House «Genius Media» LLC10.25557/2073-7998.2021.08.21-30medgen-1959Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯORIGINAL RESEARCHАномальное деметилирование и эктопическая экспрессия генов лейкотриеновых рецепторов LTB4R/LTB4R2 при раке молочной железыAbnormal demethylation and ectopic expression of leukotriene receptors genes LTB4R/LTB4R2 in breast cancerКалинкинА. И.KalinkinA. I.akalinkin@epigenetic.ruСигинВ. О.SiginV. O.noemail@neicon.ruНемцоваМ. В.NemtsovaM. V.noemail@neicon.ruКузнецоваЕ. Б.KuznetsovaE. B.noemail@neicon.ruКекееваТ. В.KekeevaT. V.noemail@neicon.ruВиноградовИ. Ю.VinogradovI. Y.noemail@neicon.ruВиноградовМ. И.VinogradovM. I.noemail@neicon.ruВиноградовИ. И.VinogradovI. I.noemail@neicon.ruЗалетаевД. В.ZaletaevD. V.noemail@neicon.ruСтрельниковВ. В.StrelnikovV. V.noemail@neicon.ruТанасА. С.TanasA. S.noemail@neicon.ruФГБНУ «Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова»РоссияResearch Centre for Medical GeneticRussian FederationФГБНУ «Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова»; ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский Университет)»РоссияResearch Centre for Medical Genetic; I. M. Sechenov First Moscow State Medical UniversityRussian FederationГБУ Рязанской области «Областной клинический онкологический диспансер»РоссияRyazan Regional Clinical Oncology DispensaryRussian FederationФГБОУ ВО «Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской ФедерацииРоссияRyazan State Medical UniversityRussian FederationГБУ Рязанской области «Областной клинический онкологический диспансер»; ФГБОУ ВО «Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской ФедерацииРоссияRyazan Regional Clinical Oncology Dispensary; Ryazan State Medical UniversityRussian Federation2021231120212082130Copyright © Калинкин А.И., Сигин В.О., Немцова М.В., Кузнецова Е.Б., Кекеева Т.В., Виноградов И.Ю., Виноградов М.И., Виноградов И.И., Залетаев Д.В., Стрельников В.В., Танас А.С., 20212021Калинкин А.И., Сигин В.О., Немцова М.В., Кузнецова Е.Б., Кекеева Т.В., Виноградов И.Ю., Виноградов М.И., Виноградов И.И., Залетаев Д.В., Стрельников В.В., Танас А.С.Kalinkin A.I., Sigin V.O., Nemtsova M.V., Kuznetsova E.B., Kekeeva T.V., Vinogradov I.Y., Vinogradov M.I., Vinogradov I.I., Zaletaev D.V., Strelnikov V.V., Tanas A.S.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.medgen-journal.ru/jour/article/view/1959

Введение. Выявление и всесторонняя характеристика новых молекулярных маркеров злокачественных опухолей остаётся актуальной задачей онкологии. Ранее по результатам проведенного авторами широкогеномного скрининга дифференциального метилирования ДНК нормальных и опухолевых тканей молочной железы (МЖ) было выявлено аномальное деметилирование CpG-островка генов LTB4R/LTB4R2 в опухолях относительно нормы. Цель. Настоящее исследование посвящено молекулярной и клинической характеристике аномального деметилирования этого CpG-островка и экспрессии генов LTB4R/LTB4R2 при раке молочной железы (РМЖ). Методы. Для разведочного анализа использовали полученные авторами ранее результаты широкогеномного бисульфитного секвенирования Xmal-RRBS 110 образцов РМЖ и 6 образцов нормальной МЖ. В этой выборке был проведен сравнительный анализ уровней метилирования CpG-динуклеотидов в нормальной и опухолевой ткани 10 образцов трижды негативного (ТН) РМЖ с аномальным деметилированием LTB4R/LTB4R2 и 6 образцов нормальной МЖ с использованием критерия Манна-Уитни. Для подтверждения аномального деметилирования в образцах ТН РМЖ было использовано бисульфитное секвенирование по Сэнгеру. Для изучения корреляции между уровнями метилирования и экспрессии и для оценки прогностической значимости экспрессии генов LTB4R/LTB4R2 использовали данные 3 уровня по измерению метилирования с чипов Illumina HumanMethylation 450K, экспрессии RNA-seq, а также клинические характеристики 731 образцов из проекта TCGA-BRCA. Отличия между кривыми Каплана-Мейера сравнивали с использованием логранкового критерия. Результаты. Определено, что аномальное деметилирование CpG-островка генов LTB4R/LTB4R2 характерно для эпигеномного подтипа умеренно метилированных образцов ТН РМЖ. Определены дифференциально метилированные CpG-динуклеотиды CpG-островка генов LTB4R/LTB4R2; их дифференциальное метилирование подтверждено бисульфитным секвенированием по Сэнгеру. Установлена отрицательная корреляция между уровнем их метилирования и экспрессией генов LTB4R и LTB4R2. Показано, что общая выживаемость достоверно снижена в группе ТН РМЖ с высокой экспрессией LTB4R, а также в группе нормально-подобных опухолей МЖ с низкой экспрессией LTB4R и в группе LumB опухолей МЖ с низкой экспрессией LTB4R2. Различия показателей выживаемости позволяют рассматривать уровни экспрессии LTB4R/LTB4R2 как прогностический маркер при РМЖ, однако следует учитывать, что прогноз зависит от молекулярного подтипа опухоли. Это относится также к использованию уровней экспрессии LTB4R/LTB4R2 в качестве потенциального предиктивного маркера чувствительности таких опухолей к ингибиторам лейкотриеновых рецепторов при проведении клинических испытаний.

Background. The identification and comprehensive characterization of new molecular markers of malignant tumors remains an urgent task of oncology. Earlier, according to the results of a genome-wide screening of differential DNA methylation of normal and tumor breast tissues, abnormal demethylation of the CpG island of LTB4R/LTB4R2 genes in tumors relative to norm was revealed. Aim. The present study focuses on the molecular and clinical characterization of abnormal demethylation of this CpG island and expression of the LTB4R/LTB4R2 genes in breast cancer (BC). Methods. For exploratory analysis, we used the previously obtained results of genome wide bisulfite sequencing of breast cancer (BC) and normal mammary gland samples. From this set, 10 samples of triple-negative (TN) breast cancer with abnormal LTB4R/LTB4R2 demethylation and 6 normal breast samples were selected, for which a comparative analysis of CpG methylation levels in cancer vs norm using the Mann-Whitney test was performed. Sanger bisulfite sequencing was used to confirm abnormal demethylation in TN BC samples. The analysis of the obtained electrophoregrams was carried out using the SeqBase software developed by the authors. To validate and assess the level of predictive significance of LTB4R/LTB4R2 gene expression, level 3 data were used to measure methylation from Illumina HumanMethylation 450K arrays, RNA-seq expression, as well as clinical characteristics for 731 samples from the TCGA-BRCA project. Kaplan-Meier curves were compared using a logrank test. Results. Abnormal demethylation of LTB4R/LTB4R2 genes in breast tumors was confirmed by Sanger sequencing. Among samples from the TCGA-BRCA project, a group of TN BC samples with low methylation of LTB4R/LTB4R2 genes was identified. Overall survival was significantly reduced in the TN breast cancer group with high LTB4R expression, as well as in the group of normal-like breast tumors with low LTB4R expression, and in the LumB group overall survival was significantly reduced when tumors demonstrated low LTB4R2 expression. Conclusions. Fine mapping of abnormal demethylation in individual CpG dinucleotides of the LTB4R/LTB4R2 genes will make it possible to design an effective PCR system that may potentially be used to define patients with TN breast cancer that would benefit from leukotriene receptor therapeutic inhibition. Different expression levels of LTB4R/LTB4R2 allow their use as a prognostic marker for breast cancer, but the prognosis directly depends on the molecular subtype of a tumor. This also applies to the use of different levels of LTB4R/LTB4R2 expression as a predictive marker of the sensitivity of such tumors to leukotriene receptor inhibitors in case they enter clinical trials.

рак молочной железыширокогеномный анализ метилирования ДНКлейкотриеновые рецепторыBreast cancergenome wide analysis of DNA methylationleukotriene receptorsReferencesBray F., Ferlay J., Soerjomataram I. et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: a cancer journal for clinicians 2018; 68(6):394-424.Bray F., Ferlay J., Soerjomataram I. et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: a cancer journal for clinicians 2018; 68(6):394-424.Bernhardt S.M., Dasari P., Walsh D. et al. Hormonal modulation of breast cancer gene expression: implications for intrinsic subtyping in premenopausal women. Frontiers in oncology 2016;6:1-16.Bernhardt S.M., Dasari P., Walsh D. et al. Hormonal modulation of breast cancer gene expression: implications for intrinsic subtyping in premenopausal women. Frontiers in oncology 2016;6:1-16.Garrido-Castro A. C., Lin N. U., Polyak K. Insights into molecular classifications of triple-negative breast cancer: improving patient selection for treatment. Cancer discovery 2019;9(2):176-198.Garrido-Castro A. C., Lin N. U., Polyak K. Insights into molecular classifications of triple-negative breast cancer: improving patient selection for treatment. Cancer discovery 2019;9(2):176-198.Криворотько П.В., Жильцова Е.К., Гиголаева Л.П. и др. Сравнительная характеристика различных схем неоадъювантной полихимиотерапии трижды негативного рака молочной железы. Опухоли женской репродуктивной системы 2017;13(4):19-23.Криворотько П.В., Жильцова Е.К., Гиголаева Л.П. и др. Сравнительная характеристика различных схем неоадъювантной полихимиотерапии трижды негативного рака молочной железы. Опухоли женской репродуктивной системы 2017;13(4):19-23.Tanas A.S., Borisova M.E., Kuznetsova E.B. et al. Rapid and Affordable Genome-Wide Bisulfite DNA Sequencing by XmaI-reduced Representation Bisulfite Sequencing. Epigenomics 2017; 9(6): 833-847.Tanas A.S., Borisova M.E., Kuznetsova E.B. et al. Rapid and Affordable Genome-Wide Bisulfite DNA Sequencing by XmaI-reduced Representation Bisulfite Sequencing. Epigenomics 2017; 9(6): 833-847.Tanas A.S., Sigin V.O., Kalinkin A.I. et al. Genome-wide methylotyping resolves breast cancer epigenetic heterogeneity and suggests novel therapeutic perspectives. Epigenomics 2019; 11(6):605-617.Tanas A.S., Sigin V.O., Kalinkin A.I. et al. Genome-wide methylotyping resolves breast cancer epigenetic heterogeneity and suggests novel therapeutic perspectives. Epigenomics 2019; 11(6):605-617.Wang D., DuBois R.N. Eicosanoids and cancer. Nature Reviews Cancer 2010;10(3):181-193.Wang D., DuBois R.N. Eicosanoids and cancer. Nature Reviews Cancer 2010;10(3):181-193.Jeon W.K., Choi J., Park S.J. et al. The proinflammatory LTB4/BLT1 signal axis confers resistance to TGF-β1-induced growth inhibition by targeting Smad3 linker region. Oncotarget 2015;6(39):41650-41666.Jeon W.K., Choi J., Park S.J. et al. The proinflammatory LTB4/BLT1 signal axis confers resistance to TGF-β1-induced growth inhibition by targeting Smad3 linker region. Oncotarget 2015;6(39):41650-41666.Choi J.A., Lee J.W., Kim H. et al. Pro-survival of estrogen receptor-negative breast cancer cells is regulated by a BLT2-reactive oxygen species-linked signaling pathway. Carcinogenesis 2009;31(4):543-551.Choi J.A., Lee J.W., Kim H. et al. Pro-survival of estrogen receptor-negative breast cancer cells is regulated by a BLT2-reactive oxygen species-linked signaling pathway. Carcinogenesis 2009;31(4):543-551.Park G.S., Kim J.H. LPS up-regulates ICAM-1 expression in breast cancer cells by stimulating a MyD88-BLT2-ERK-linked cascade, which promotes adhesion to monocytes. Molecules and cells 2015;38(9):821-828.Park G.S., Kim J.H. LPS up-regulates ICAM-1 expression in breast cancer cells by stimulating a MyD88-BLT2-ERK-linked cascade, which promotes adhesion to monocytes. Molecules and cells 2015;38(9):821-828.Kim H., Choi J.A., Park G.S. et al. BLT2 up-regulates interleukin-8 production and promotes the invasiveness of breast cancer cells. PLoS One 2012;7(11):e49186.Kim H., Choi J.A., Park G.S. et al. BLT2 up-regulates interleukin-8 production and promotes the invasiveness of breast cancer cells. PLoS One 2012;7(11):e49186.Weinstein J.N., Collisson E.A., Mills G.B. et al. The cancer genome atlas pan-cancer analysis project. Nature genetics 2013;45(10):1113.Weinstein J.N., Collisson E.A., Mills G.B. et al. The cancer genome atlas pan-cancer analysis project. Nature genetics 2013;45(10):1113.Tanas A.S., Kuznetsova E.B., Borisova M.E., Rudenko V.V., Zaletayev D.V., Strelnikov V.V. Reduced representation bisulfite sequencing design for assessing the methylation of human CpG islands in large samples. Molecular Biology 2015;49(4):618-626.Tanas A.S., Kuznetsova E.B., Borisova M.E., Rudenko V.V., Zaletayev D.V., Strelnikov V.V. Reduced representation bisulfite sequencing design for assessing the methylation of human CpG islands in large samples. Molecular Biology 2015;49(4):618-626.Li L.C., Dahiya R. MethPrimer: designing primers for methylation PCRs. Bioinformatics 2002;18(11):1427-1431.Li L.C., Dahiya R. MethPrimer: designing primers for methylation PCRs. Bioinformatics 2002;18(11):1427-1431.Абрамычева Н.Ю., Федотова Е.Ю., Нужный Е.П. и др. Эпигенетика болезни Фридрейха: метилирование области экспансии (GAA) n-повторов гена FXN. Вестник Российской академии медицинских наук 2019;74(2):80-87.Абрамычева Н.Ю., Федотова Е.Ю., Нужный Е.П. и др. Эпигенетика болезни Фридрейха: метилирование области экспансии (GAA) n-повторов гена FXN. Вестник Российской академии медицинских наук 2019;74(2):80-87.Zemliakova V.V., Strelnikov V.V., Zborovskaia I.B. et al. Abnormal methylation of p16/CDKN2A AND p14/ARF genes GpG Islands in non-small cell lung cancer and in acute lymphoblastic leukemia. Molekuliarnaia biologiia. 2004;38(6):966-972.Zemliakova V.V., Strelnikov V.V., Zborovskaia I.B. et al. Abnormal methylation of p16/CDKN2A AND p14/ARF genes GpG Islands in non-small cell lung cancer and in acute lymphoblastic leukemia. Molekuliarnaia biologiia. 2004;38(6):966-972.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.