medgenМедицинская генетикаMedical Genetics2073-7998Publishing House «Genius Media» LLCmedgen-185Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯORIGINAL RESEARCHУстранение экспериментальных отклонений при количественном анализе профилей метилирования ДНК посредством высокопроизводительного бисульфитного секвенирования и гибридизации на олигонуклеотидных ДНК-чипахCorrection of measurement biases in DNA methylation studies by means of next generation sequencing and hybridisation on oligonucleotide microarraysМоскалевЕ. А.MoskalevE. A.moskalyov@mail.ruЗавгороднийМ. Г.ZavgorodnijM. G.noemail@neicon.ruМайороваС. П.MajorovaS. P.noemail@neicon.ruЛебедевИ. Н.LebedevI. N.noemail@neicon.ruИнститут патологии, Университет Фридриха-Александра в Эрлангене и Нюрнберге; Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наукРоссияInstitute of Pathology, Friedrich-Alexander-University of Erlangen-Nuremberg; Tomsk National Research Medical Center, Russian Academy of SciencesRussian FederationВоронежский государственный университетРоссияVoronezh State UniversityRussian FederationВоронежский государственный технический университетРоссияVoronezh State Technical UniversityRussian FederationТомский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наукРоссияTomsk National Research Medical Center, Russian Academy of SciencesRussian Federation2016260120171511916Copyright © Москалев Е.А., Завгородний М.Г., Майорова С.П., Лебедев И.Н., 20172017Москалев Е.А., Завгородний М.Г., Майорова С.П., Лебедев И.Н.Moskalev E.A., Zavgorodnij M.G., Majorova S.P., Lebedev I.N.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.medgen-journal.ru/jour/article/view/185

Количественный анализ профилей метилирования ДНК является неотъемлемым аспектом исследований в области эпигенетических механизмов онкогенеза. Кроме того, детекция опухолеспецифичных эпигенетических аномалий обладает высоким диагностическим потенциалом. При анализе генов-кандидатов, как правило, используют ПЦР-амплификацию модифицированных бисульфитом генных областей. Поскольку измерение степени метилирования CpG-динуклеотидов происходит в ампликонах, ПЦР определяет точность всего анализа. Избирательная амплификация форм ДНК, различающихся характером метилирования, может затруднять интерпретацию результатов. Дополнительные экспериментальные искажения могут быть связаны с особенностями технологий детекции метилированных оснований, например специфичностью олигонуклеотидных зондов ДНК-чипов. Целью работы было исследование применимости предложенного нами ранее алгоритма для устранения экспериментальных искажений из количественных данных метилирования ДНК, которые получены методами высокопроизводительного бисульфитного секвенирования и гибридизации на олигонуклеотидных ДНК-чипах. Материалы и методы. Для количественной характеристики профилей метилирования ДНК вблизи точек начала транскрипции генов-кандидатов использованы методы высокопроизводительного бисульфитного секвенирования по технологии 454 и гибридизации на ДНК-чипах «Febit Biotech». Регрессионный анализ полученных величин метилирования ДНК проводили посредством кубических полиномиальных кривых. Результаты. Для анализа были выбраны гены, аномальное гиперметилирование которых обнаруживается в злокачественных новообразованиях: кодирующие субъединицы фермента сукцинатдегидрогеназы SDH , а также онкосупрессоры CDKN2B , DAPK1 и TP53 . Анализируемые регионы амплифицировали в контрольных пробах ДНК известной степени метилирования. Амплификация и последующее секвенирование ампликонов SDHB и SDHD выявили значительные отклонения от ожидаемых величин метилирования. Аналогично индексы метилирования рассмотренных CpG-динуклеотидов в генах CDKN2B и DAPK1 существенно искажались при гибридизации на ДНК-чипе. С помощью уравнений полученных кубических регрессионных кривых была проведена корректировка исходных данных с практически полным устранением артефактов. Выводы. Применение кубической полиномиальной регрессии для корректировки экспериментальных искажений в двух разных типах количественных данных метилирования ДНК - полученных высокопроизводительным бисульфитным секвенированием и гибридизацией на олигонуклеотидных ДНК-чипах - продемонстрировало практически полное устранение артефактов, и, следовательно, универсальность метода.

Quantitative analysis of DNA methylation patterns is an intrinsic part of epigenetic cancer research. Besides, detection of tumour specific epigenetic aberrations holds promise for cancer diagnostics. PCR amplification of loci of interest from bisulfite treated DNA is a common sample preparation step. Given the fact amplicons and not the genomic DNA is used for quantification of the methylation percentages, the PCR amplification step is limiting factor for the accuracy of the entire analysis. Preferential amplification of either methylated or unmethylated alleles may hamper the correct interpretation of results. Additional biases may be introduced by the quantification technologies on their own, for example the specificity of oligonucleotide probes of a microarray. Aim. The aim of present work was to evaluate the applicability of the cubic polynomial regression for correction of measurement biases in quantitative DNA methylation data that were obtained by the next generation sequencing and hybridisation analysis on the oligonucleotide microarrays. Materials and Methods. Next generation bisulfite 454 sequencing and hybridisation on the in situ synthesised microarrays (Febit Biotech) was employed to quantify DNA methylation in vicinity of the transcriptional start sites. Cubic polynomial regression was used to analyse the calibration data. Results. Candidate genes were selected that exhibit aberrant DNA methylation patterns in cancer. Specifically, these included genes coding for the subunits of succinate dehydrogenase ( SDH ) as well as tumour suppressor genes CDKN2B , DAPK1 and TP53 . The interrogated DNA loci were amplified from control DNA samples of defined methylation percentages. Substantial deviations of apparent methylation percentages from theoretically expected values were detected by the sequencing of SDHB and SDHD amplicons. Likewise, the methylation indices of the CDKN2B and DAPK1 CpG sites that were analysed were significantly biased in the microarray data. Correction of biased data was performed by using the equations of respective regression curves resulting in almost complete removal of the artefacts. Conclusions. Successful application of cubic polynomial regression was achieved for correcting measurement biases in two different types of quantitative DNA methylation data - namely next generation bisulfite sequencing and hybridisation on the oligonucleotide microarrays - demonstrating the universal applicability of this correction process.

метилирование ДНКколичественный анализПЦР-отклонениекубическая регрессиявысокопроизводительное бисульфитное секвенированиеолигонуклеотидные ДНК-чипыDNA methylationquantitative analysisPCR-biascubic polynomial regressionnext-generation sequencingoligonucleotide microarraysReferencesПономарева А.А., Рыкова Е.Ю., Чердынцева Н.В. и др. Анализ уровень метилирования гена RARb2 в циркулирующих ДНК крови у больных раком легкого как потенциального прогностического маркера. Вопросы онкологии. 2011;57(3):302-307.Пономарева А.А., Рыкова Е.Ю., Чердынцева Н.В. и др. Анализ уровень метилирования гена RARb2 в циркулирующих ДНК крови у больных раком легкого как потенциального прогностического маркера. Вопросы онкологии. 2011;57(3):302-307.Брызгунова О.Е., Лактионов П.П. Формирование пула циркулирующих ДНК крови: источники, особенности строения и циркуляции. Биомедицинская химия. 2015;61(4):409-426.Брызгунова О.Е., Лактионов П.П. Формирование пула циркулирующих ДНК крови: источники, особенности строения и циркуляции. Биомедицинская химия. 2015;61(4):409-426.Miettinen M., Lasota J. Gastrointestinal stromal tumors: pathology and prognosis at different sites. Semin Diagn Pathol. 2006;23(2).70-83.Miettinen M., Lasota J. Gastrointestinal stromal tumors: pathology and prognosis at different sites. Semin Diagn Pathol. 2006;23(2).70-83.Haller F., Zhang J.D., Moskalev E.A. et al. Combined DNA methylation and gene expression profiling in gastrointestinal stromal tumors (GISTs) reveals hypomethylation of SPP1 as an independent prognostic factor. International Journal of Cancer. 2015;136(5):1013-1023.Haller F., Zhang J.D., Moskalev E.A. et al. Combined DNA methylation and gene expression profiling in gastrointestinal stromal tumors (GISTs) reveals hypomethylation of SPP1 as an independent prognostic factor. International Journal of Cancer. 2015;136(5):1013-1023.Gausachs M., Pilar M., Corral J. et al. MLH1 promoter hypermethylation in the analytical algorithm of Lynch syndrome& a costsseffectiveness study. Eur J Hum Genet. 2012; 20(7):762-768.Gausachs M., Pilar M., Corral J. et al. MLH1 promoter hypermethylation in the analytical algorithm of Lynch syndrome& a costsseffectiveness study. Eur J Hum Genet. 2012; 20(7):762-768.Bettstetter M., Dechant S., Ruemmele P. et al. Distinction of hereditary nonpolyposis colorectal cancer and sporadic microsatellite-unstable colorectal cancer through quantification of MLH1 methylation by real-time PCR. Clin Cancer Res. 2007;13:3221-3228.Bettstetter M., Dechant S., Ruemmele P. et al. Distinction of hereditary nonpolyposis colorectal cancer and sporadic microsatellite-unstable colorectal cancer through quantification of MLH1 methylation by real-time PCR. Clin Cancer Res. 2007;13:3221-3228.Haller F., Moskalev E.A., Faucz F.R. et al. Aberrant DNA hypermethylation of SDHC: a novel mechanism of tumor development in Carney Triad. Endocrine Related Cancer. 2014;21(4):567-577.Haller F., Moskalev E.A., Faucz F.R. et al. Aberrant DNA hypermethylation of SDHC: a novel mechanism of tumor development in Carney Triad. Endocrine Related Cancer. 2014;21(4):567-577.Frommer M., McDonald L.E., Millar D.S. et al. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc Natl Acad Sci USA. 1992;89(5):1827-1831.Frommer M., McDonald L.E., Millar D.S. et al. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc Natl Acad Sci USA. 1992;89(5):1827-1831.Warnecke P.M., Stirzaker C., Melki J.R. et al. Detection and measurement of PCR bias in quantitative methylation analysis of bisulphite-treated DNA. Nucleic Acids Research. 1997;25(21):4422-4426.Warnecke P.M., Stirzaker C., Melki J.R. et al. Detection and measurement of PCR bias in quantitative methylation analysis of bisulphite-treated DNA. Nucleic Acids Research. 1997;25(21):4422-4426.Moskalev E.A., Zavgorodnij M.G., Majorova S.P. et al. Correction of PCR-bias in quantitative DNA methylation studies by means of cubic polynomial regression. Nucleic Acids Research. 2011;39(11):e77.Moskalev E.A., Zavgorodnij M.G., Majorova S.P. et al. Correction of PCR-bias in quantitative DNA methylation studies by means of cubic polynomial regression. Nucleic Acids Research. 2011;39(11):e77.Shen L., Guo Y., Chen X. et al. Optimizing annealing temperature overcomes bias in bisulfite PCR methylation analysis. BioTechniques. 2007;42(1):48-58.Shen L., Guo Y., Chen X. et al. Optimizing annealing temperature overcomes bias in bisulfite PCR methylation analysis. BioTechniques. 2007;42(1):48-58.Wojdacz T.K., Hansen L.L., Dobrovic A. A new approach to primer design for the control of PCR bias in methylation studies. BMC Res. Notes. 2008;1:54.Wojdacz T.K., Hansen L.L., Dobrovic A. A new approach to primer design for the control of PCR bias in methylation studies. BMC Res. Notes. 2008;1:54.Москалев Е.А. Аномальные картины метилирования геномной ДНК при хроническом B-клеточном лимфолейкозе.: дис. канд. биол. наук. Воронежский государственный университет, Воронеж, 2007.Москалев Е.А. Аномальные картины метилирования геномной ДНК при хроническом B-клеточном лимфолейкозе.: дис. канд. биол. наук. Воронежский государственный университет, Воронеж, 2007.Rohde C., Zhang Y., Reinhardt R. et al. BISMA - fast and accurate bisulfite sequencing data analysis of individual clones from unique and repetitive sequences. BMC Bioinformatics. 2010;11:230.Rohde C., Zhang Y., Reinhardt R. et al. BISMA - fast and accurate bisulfite sequencing data analysis of individual clones from unique and repetitive sequences. BMC Bioinformatics. 2010;11:230.Guimil R., Beier M., Scheffler M. et al. Geniom technology - the benchtop array facility. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2003;22(5-8):1721-1723.Guimil R., Beier M., Scheffler M. et al. Geniom technology - the benchtop array facility. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2003;22(5-8):1721-1723.Mund C., Beier V., Bewerunge P. et al. Array-based analysis of genomic DNA methylation patterns of the tumour suppressor gene p16INK4A promoter in colon carcinoma cell lines. Nucleic Acids Res. 2005;33(8):e73.Mund C., Beier V., Bewerunge P. et al. Array-based analysis of genomic DNA methylation patterns of the tumour suppressor gene p16INK4A promoter in colon carcinoma cell lines. Nucleic Acids Res. 2005;33(8):e73.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.